Efeitos de compostos fenólicos naturais sobre a proliferação e viabilidade de células estreladas hepáticas ativadas

Abstract

A presença de compostos fenólicos nas dietas ricas em frutas e vegetais tem atraído a atenção de diversos pesquisadores devido aos seus efeitos antioxidantes, os quais atuam na prevenção e combate de diversos tipos de enfermidades. O Brasil é um país com rica diversidade de flora e fauna, o qual apresenta um grande potencial para a descoberta de substâncias que já são utilizadas há muito tempo na medicina popular, mas ainda não possuem comprovação científica. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo verificar o potencial antioxidante de extratos de frutas nativas do Brasil através da determinação dos compostos bioativos e capacidade antioxidante in vitro, a fim de selecionar uma fruta que apresentasse efeitos biológicos promissores sobre a proliferação, viabilidade celular e mecanismos de resolução do estado de ativação de células estreladas hepáticas ativadas. Os extratos de amora-preta (Rubus sp.) Xavante e pitanga roxa (Eugenia uniflora L.) apresentaram o maior conteúdo de compostos fenólicos totais, sendo que diversos compostos foram identificados nestas frutas, como derivados de quercetina, quercitrina, isoquercitrina e cianidina-3- glicosídio, entre outros, os quais podem estar contribuindo para a elevada capacidade antioxidante destas frutas. A maior atividade antioxidante no ensaio DPPH foi observada no extrato de pitanga roxa, que também apresentou maior atividade nos ensaios de FRAP e TRAP, sendo, portanto a fruta de escolha para os testes de atividade biológica em cultura de células. O extrato de pitanga roxa reduziu significativamente, e de modo dose-dependente, a viabilidade e proliferação celular das células estreladas hepáticas ativadas (linhagem celular GRX), além de promover alterações no ciclo celular. Também observamos uma redução significativa na massa e potencial de membrana mitocondrial nas células tratadas com 5, 50 e 100 µg/mL do extrato, o que pode estar relacionado com o aumento na morte celular por apoptose e necrose observada neste estudo. Além disso, observamos um aumento significativo na granulosidade citoplasmática das células tratadas com 50 e 100 µg/mL do extrato de pitanga roxa, o que foi provocado pelo aumento no número de autofagossomos e autolisossomos observados por microscopia eletrônica de transmissão. A indução da autofagia e mitofagia foram comprovadas pela presença de organelas vacuolares ácidas coradas por acridine orange, pelo aumento da expressão da proteína relacionada com a autofagia, Atg7, e pelo aumento da colocalização de mitocôndrias e lisossomas nas células tratadas. Este é o primeiro estudo demonstrando o efeito do extrato de pitanga roxa sobre a resolução do estado de ativação das células estreladas hepáticas. Porém, mais estudos devem ser realizados para verificar o efeito desta fruta sobre as outras células hepáticas envolvidas na fibrose hepática, além de avaliar o efeito in vivo deste extrato em modelos experimentais de fibrose em animais.

The presence of phenolic compounds in the diets rich in fruits and vegetables has attracted the attention of many researchers due to its antioxidant effects, which act to prevent various types of diseases. Brazil is a country with rich diversity of flora and fauna, which has great potential for the discovery of substances that are already used for a long time in folk medicine, but do not yet have scientific proof. Therefore, this study aimed to determine the antioxidant potential of fruit extracts native to Brazil through the determination of bioactive compounds and antioxidant capacity in vitro, in order to select a fruit that could promising biological effects on proliferation, cell viability and resolution mechanisms of activation of hepatic stellate cells. The extracts of blackberry (Rubus sp.) Xavante and purple pitanga (Eugenia uniflora L.) had the highest total phenolic content, and several compounds were identified in these fruits, as quercetin derivatives, quercitrin, isoquercitrin and cyanidin-3-glycoside, among others, which may be contributing to the high antioxidant capacity of these fruits. The highest antioxidant activity in DPPH assay was observed in purple pitanga extract, which also showed the highest antioxidant activity in FRAP and TRAP assays and therefore was the fruit of choice for testing your biological activity in cell culture. The purple pitanga extract reduced significantly and dose-dependent manner, the viability and proliferation of activated hepatic stellate cells (GRX cell line), as well as promoting changes in the cell cycle. We also observed a significant reduction in the mass and mitochondrial membrane potential in cells treated with 5, 50 e 100 µg/mL of the extract, which may be related to the increase in cell death by apoptosis and necrosis in this study. Moreover, we observed a significant increase in cytoplasmic granularity of cells treated with 50 e 100 µg/mL of purple pitanga extract, which was caused by the increase in the number of autophagosomos and autolysosomes observed by transmission electron microscopy. Induction of autophagy and mitophagy were confirmed by the presence of acidic vacuolar organelles stained by acridine orange, increased expression of autophagy-related protein, Atg7, and increased colocalization of mitochondria and lysosomes in cells treated. This is the first study demonstrating the effect of purple pitanga extract on the resolution of activation state of hepatic stellate cells. However, more studies should be conducted to verify the effect of this fruit on other liver cells involved in liver fibrosis, and to evaluate the effect of this extract in experimental models of fibrosis in vivo.