Obtenção do gangliosídio GM3 de baço de cachorro

Abstract

Gangliosídios são glicolipídios que possuem em sua estrutura obrigatoriamente um derivado de ácido siálico. Estes compostos existem em grande quantidade nas membranas plasmáticas das células, exercem papel importante nos processos de diferenciação celular e neurotransmissão. Duas enzimas chaves controlam a biossíntese dos diferentes gangliosídios: GD3 sintase e GM2 sintase. A primeira transfere um resíduo de ácido siálico ao GM3 a partir de CMP-NANA e a segunda transfere N-Ac-galactosamina ao GM3 a partir de UDP-N-Ac-Gal. Portanto para a medida das atividades destas enzimas é necessário, além dos nucleotídios doadores de açúcar, o gangliosídio GM3. Quantidades razoáveis deste composto são encontradas em baço de cachorro. Este órgão foi extraído, particionado conforme o método de Folch-Pi, e a fase superior passada através de uma coluna de DEAE-sephadex A-50 segundo Nores e Caputto (J. Neurochem., v.42, n.5, p.1205-1211, 1984). Os diferentes gangliosídios foram eluídos da seguinte forma: monogangliosídios com clorofórmio: metanol: formiato de amônio 0,08M (30:60:8); digangliosídios com clorofórmio:metanol:formiato de amônio 0,25M (30:60:8); trigangliosídios com clorofórmio:metanol:formiato de amônio 0,4M (30:60:8). Obteve-se uma maior recuperação no pico I da coluna, correspondente aos monogangliosídios. Uma CCD analítica desta tração em sílica gel-G-60 revelou a presença de 2 bandas majoritárias as quais migram como GM3 padrão. Provavelmente sejam duas isoformas de GM3 que se diferenciam na composição de ácido graxo. Para melhor purificação de GM3 fez-se a seguir CCD preparativa. Ao final do método de preparação conseguiu-se de aproximadamente 40g de baço, cerca de 1mg de GM3.

Obtention of Ganglioside GM3from Dog Spleen. Ganglioside is the generic term for glycosphingolipids containing sialic acids, which are a group of derivates of neuraminic acid. These compounds are present in large quantities in plasma cell membranes and may form part of receptores for neurotransmitters, peptides hormones and bacterial toxins. Two key enzymes control the biosynthesis of the different gangliosides: GD3synthase and GM2synthase. Both enzymes require GM3as one of their substrates. The first transfers one residue of sialic acid from the sugar nucleotide donor CMP-NANA to the acceptor GM3and the second transfers N-Ac-Galactosamine from UDP-N-Ac-Gal to GM3. For measuring the activity of these enzymes, the sugar donors and the ganglioside GM3are required. Suitable quantities of this compound are found in dog spleen. This tissue was extractet and partitioned according to Folch-Pi Method. The upper phase was passed trough a DEAE-Sephadex A-50 column according to Nores and Caputto (J. Neurochem., v.42, n.5, p.1205-1211, 1984) The different gangliosides were eluted as follows: monogangliosides with chloroform: methanol: ammonium formate 0.08 M (30:60:8); digangliosides with chloroform:methanol:ammonium formate 0.25 M (30:60:8) and trigangliosides with chloroform:methanol:ammonium formate 0.4 M (30:60:8). The best recovery of eluted gangliosides was that corresponding to monogangliosides. Analytical TLC of this fraction on Silica-gel G-6O was developed with C:M:NH4OHconc:H20 (55:40:2:8) and showed the presence of 2 major bands which migrated as GM3standard. This is attribuited to the existence of two isomer forms of GM3with variable fatty acid composition. For further purification of GM3preparative TLC was carried out. Approximately 1mg of GM3was obtained from 40g of dog spleen with this approach.