Avaliação dos níveis de autofagia e morfometria nuclear no carcinoma epidermoide de esôfago

Abstract

O câncer de esôfago é a sexta causa de morte relacionada a neoplasias malignas no mundo. A taxa de sobrevida em 5 anos é inferior a 20 %, após o diagnóstico. O conhecimento da biologia básica e o desenvolvimento de novos marcadores diagnósticos e prognósticos podem contribuir para o manejo clínico desses tumores. A autofagia é um mecanismo fisiológico envolvido na degradação de organelas e proteínas disfuncionais ou envelhecidas. Perturbações na autofagia têm sido associadas à carcinogênese. Em nosso estudo: (a) comparamos os níveis de três indicadores de autofagia, SQSTM1, MAP1LC3B e BECN1 no epitélio esofágico não neoplásico e em amostras de carcinoma epidermoide de esôfago (ESCC); (b) analisamos a influência da idade, sexo e tabagismo no nível desses indicadores; (c) avaliamos a morfometria nuclear e sua correlação com a autofagia; e (d) examinamos a influência da autofagia na taxa de sobrevida e no estadiamento do ESCC. Para isso, selecionamos 32 biópsias de esôfago sem alterações associadas a neoplasia (grupo controle) e 53 amostras de ESCC. O material foi imunomarcado para SQSTM1, MAP1LC3B e BECN1, seguido da quantificação dos níveis proteicos e geração de um Índice Autofágico para cada amostra. Também foi realizada a análise morfométrica nuclear. A influência da autofagia nas taxas de sobrevida dos pacientes com ESCC foi estimada usando o banco de dados TCGA. Observamos um aumento nos níveis dos três indicadores de autofagia nas amostras de ESCC comparadas com o grupo controle. O AutoIndex, que acreditamos melhor representar o estado autofágico, comparado aos indicadores isolados, demonstrou diferença ainda maior entre os grupos. Encontramos uma redução na área nuclear no ESCC em comparação às amostras controle. Essa redução se correlacionou negativamente com o AutoIndex, sugerindo que alterações nucleares e na autofagia ocorrem concomitantemente ao longo da carcinogênese do ESCC. Utilizando o TCGA identificamos níveis elevados de MAP1LC3A/B, SQSTM1, Atg4A e Atg12 associados a um pior prognóstico e estadiamento avançado, sugerindo que a autofagia no ESCC contribua para a agressividade tumoral. Ainda usando o TCGA verificamos que a combinação de genes de autofagia dois a dois apresenta uma diferença ainda maior nas curvas de Kaplan-Meier entre pacientes com níveis elevados e baixos de autofagia. Ao final, a partir dos nossos resultados e dados da literatura, levantamos a hipótese de que quanto maior a diferença, para mais ou menos, da intensidade da autofagia em um tumor em relação ao tecido não neoplásico, pior o prognóstico. Em conclusão, observamos um aumento da autofagia no ESCC, e sugerimos que a combinação de indicadores deste mecanismo, mais do que o uso de marcadores isolados, tem potencial para uso na avaliação prognóstica no ESCC.

Esophageal cancer is the sixth leading cause of deaths by malignant neoplasias in the word. Less than 20 % of patients survive 5 years after diagnosis, so the knowledge of basic tumor biology as well as the development of new prognostic markers may contribute to the management of these tumors. Autophagy is a physiological mechanism involved in the degradation of aged or dysfunctional organelles and proteins. Disturbs in autophagy have been associated with the carcinogenesis. Here, we: (a) compared the levels of three autophagy markers, SQSTM1, MAP1LC3B and BECN1 in non-neoplastic esophagus and in Esophagus Squamous Cell Carcinoma (ESCC) samples; (b) assessed the influence of age, gender and smoking in the level of these markers; (c) evaluate nuclear morphometry and its correlation with autophagy; and (d) examined the influence of autophagy genes expression in the survival and staging of ESCC. We select 32 non-neoplastic esophageal samples (control group) and 53 ESCC samples, which were immunostained to SQSTM1, MAP1LC3B and BECN1, followed by the quantification of these proteins levels and the generation of an Autophagic Index (AutoIndex) to each sample. Nuclear morphometry was assessed by the Nuclear Morphometric Analysis. The influence of autophagy in the overall survival time of ESCC patients was estimated using the TCGA database. We found that the three autophagy markers were significantly increased in ESCC samples in comparison to non-neoplastic samples. The AutoIndex, which we believe that better represents the autophagic status of a given sample, then single markers, showed an even higher difference between groups. We found a reduction in nuclear area in ESCC in comparison to controls. This reduction correlated negatively with AutoIndex, suggesting these alterations in the structure of the chromatin and autophagy occur concomitantly along the carcinogenesis of ESCC. Using the TCGA data bank we found that high levels of MAP1LC3 A/B, SQSTM1, Atg4A and Atg12 gene expression were associated with a poor prognosis and advanced staging, suggesting that autophagy contributes to tumor aggressiveness. The combination of autophagy gene markers two by two showed an even larger gap in Kaplan-Meier curves between patients with low and high levels of autophagy. Based on our data and those from the literature we raised the hypothesis that the greater the difference of autophagy in tumours compared to non-neoplastic tissue, the poorer the prognosis, regardless the alteration is up or down regulated. In conclusion, we found that an increase in autophagy may be involved in the progression of ESCC, and that the combination, more than a single marker analysis, has the potential to be used as a prognostic index in ESCC.