Desenvolvimento e avaliação da atividade neuroprotetora de nanoemulsões revestidas por quitosana contendo ácido rosmarínico administradas pela via nasal

Abstract

As doenças neurodegenerativas (DN) são caracterizadas pela perda lenta e progressiva neuronal, com limitadas estratégias terapêuticas capazes de evitar sua progressão. O ácido rosmarínico (AR) é um composto encontrado em várias espécies vegetais com potencial neuroprotetor bem descrito na literatura. No entanto, devido a sua baixa biodisponibilidade oral e no sistema nervoso central, novas abordagens tem sido investigadas para contornar as limitações do AR. A presente tese objetivou desenvolver nanoemulsões (NE) revestidas por quitosana contendo AR para administração nasal visando uma terapia neuroprotetora. Inicialmente, um método rápido, simples e indicativo de estabilidade por cromatografia líquida de ultra-eficiência para determinação do AR em NE e mucosa nasal suína foi validado seguindo as guias oficiais. O método demonstrou ser específico, linear (0,5 – 10,0 μg.mL-1), preciso, exato e robusto para a determinação do AR em diferentes matrizes biológicas. Após, NE compostas por triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo e revestidas com quitosana, foram otimizadas por meio de um desenho experimental do tipo Box-Behnken. O modelo experimental mostrou-se adequado e a condição ótima foi estabelecida minimizando as respostas de tamanho de gotícula (259,07 ± 5,93 nm) e índice de polidispersão (0,274 ± 0,01) e maximizando os resultados de potencial zeta (45,73 ± 1,76 mV) e o teor de AR (92,66 ± 1,43 %). As propriedades físico-químicas e o potencial mucoadesivo das NE otimizadas foram caracterizados. O perfil de liberação/permeação do AR mostrou-se prolongado a partir das NE, com um aumento de retenção na mucosa nasal suína. Estudos in vitro de viabilidade e de marcação de necrose celular em fibroblastos (MRC-5) foram realizados, não sendo observada toxicidade em concentrações inferiores a 25 μM após 48 h de tratamento. Na sequência, a atividade glioprotetora das NE em modelo de inflamação e estresse oxidativo induzido por lipopolissacarídeo (LPS) em cultura primária de astrócitos foi investigada. Foi observado que o pré-tratamento com as NE é capaz de proteger o dano induzido pelo LPS, através da redução da disfunção mitocondrial, aumento do status antioxidante e da prevenção da ativação capacidade migratória dos astrócitos e do acúmulo de astrócitos reativos. Por fim, estudos in vivo em modelo de perda de memória induzido por LPS em ratos Wistar foram realizados, sendo evidenciada uma proteção contra o déficit de memória induzido por LPS, além de aumentar a disponibilidade cerebral do AR, confirmada pela quantificação de AR nos cérebros dos ratos (0,173 ± 0,038 μg). Em conclusão, esse estudo demonstra as potencialidades das NE contendo AR administradas por via nasal como potencial estratégia na terapia neuroprotetora para tratamento de ND.

Neurodegenerative disorders (ND) are characterized by progressive and slow neuronal loss, with limited therapeutic strategies that prevents its progression. Rosmarinic acid (RA) is a natural phenolic compound commonly found in various medicinal plants, with a welldocumented neuroprotective effect. Nevertheless, due to its poor oral and central nervous system bioavailability, new approaches have been investigated to circumvent the RA limitations. The present thesis aimed to develop RA chitosan-coated nanoemulsions (NE) for nasal delivery aiming a neuroprotective therapy. Initially, a fast, simple and stability-indicating ultra-fast liquid chromatography method for the RA determination in NE and nasal mucosa was developed and successfully validated according to the official guidelines. The method showed to be specific, linear (0.5 - 10.0 μg.mL-1), precise, accurate and robust for RA determination in different biological matrices. After, NE composed by medium chain triglycerides and egglecithin, coated by chitosan were optimized using a Box-Behnken design. The experimental model was adequate, and the optimal condition was stablished with the minimum droplet size (259.07 ± 5.93 nm) and polydispersity index (0.274 ± 0.01), and the maximal ζ-potential (45.73 ± 1.76 mV) and content of RA (92.66 ± 1.43 %). The physicochemical properties and the mucoadhesive potential of the optimized NE were characterized. The RA release / permeation profile was extended from NE, with increased retention in the porcine nasal mucosa. In vitro studies of cell viability and necrosis in fibroblasts (MRC-5) were performed. No cytotoxicity was observed at concentrations below 25 μM after 48 h of treatment. Afterwards, the glioprotective activity of NE in lipopolysaccharide-induced (LPS) inflammation and oxidative stress model in rat astrocyte primary culture was investigated. It was observed that pre-treatment with NE can protect LPS-induced damage by reducing mitochondrial dysfunction, increasing antioxidant status and preventing migratory activation of astrocytes and accumulation of reactive astrocytes. Finally, in vivo studies on the LPS-induced memory impairment model in Wistar rats were performed, demonstrating a neuroprotective effect against LPS-induced memory deficit, as well as increasing the cerebral RA availability, confirmed by the quantification of RA in the brains of mice (0.173 ± 0.038 μg). In conclusion, this study demonstrates the potentialities of RA NE administered by nasal route as a potential strategy in neuroprotective therapy for ND treatment.