Investigação dos possíveis papéis de vesículas extracelulares e suas proteínas na transferência intercelular de resistência à cisplatin em adenocarcinoma de pulmão humano

Abstract

Muitos pacientes com câncer de pulmão possuem tumores em estágio avançado, sendo que a principal droga utilizada para o seu tratamento é a cisplatina (CDDP). O uso da CDDP é limitado, pois tumores podem adquirir resistência a sua ação. Vesículas extracelulares (VEs) apresentam funções na transferência de quimiorresistência entre células tumorais, sendo que proteínas participam desse efeito. O estudo do perfil proteico de VEs de células tumorais sensíveis e resistentes a drogas permite compreender melhor os mecanismos dessa transferência. Portanto, este trabalho focou na investigação dos possíveis papéis de VEs e suas proteínas na transferência intercelular de resistência entre células humanas de adenocarcinoma de pulmão sensíveis e resistentes à CDDP. Sublinhagem celular com resistência (RA-A549) foi estabelecida, expondo a linhagem A549 a concentrações de CDDP. Após, foram realizados cocultivos transwell entre as células RA-A549 com células A549 para verificar a internalização celular de VEs e para avaliar a transferência de resistência entre as linhagens. No ensaio de transferência, células A549 foram cocultivadas com células A549 ou RA-A549 na presença ou não de CDDP por 72 h e, após, marcadas com FDA. As VEs foram isoladas do sobrenadante de cultivo pelo método de centrifugação diferencial e ultracentrifugação e analisadas por diferentes técnicas. As proteínas de VEs isoladas de RA-A549 e A549 foram analisadas por LC-MS/MS. A sublinhagem RA-A549 apresentou valor de IC50 superior ao da linhagem A549 (cerca de 4,5 vezes). Células A549 cocultivadas com RA-A549 foram capazes de internalizar as VEs de RA-A549 e apresentaram uma menor sensibilidade a CDDP (p < 0,001), sugerindo transferência intercelular de quimiorresistência. As VEs isoladas apresentaram diâmetro variável (10-420 nm), com predominância de ~100 nm, sendo que a sua presença foi ainda confirmada por detecção da proteína CD63. Foram identificadas 225 proteínas diferentes nas VEs das células A549 e RA-A549, entre essas, marcadores clássicos de VEs, como CD9, CD8, Alix, anexinas, Rab GTPases e HSPs. Foram identificadas proteínas nas VEs potencialmente envolvidas na transferência de resistência a CDDP e associadas com a proliferação e adesão celular, o bloqueio de fluxo da droga, invasão e migração celular, evasão de apoptose, atenuação do sistema imune e da coagulação, angiogênese, regulação do ciclo celular, o reparo de DNA, modulação do metabolismo energético, o efluxo ou a neutralização da droga, degradação proteica, reorganização da estrutura e formato das células tumorais.

Many patients with lung cancer have tumors in advanced stage and the main drug used for their treatment is cisplatin (CDDP). The CDDP use is limited, because tumors may become resistant to their action. Extracellular vesicles (EVs) have functions in chemoresistance transfer between tumor cells and proteins participate in this effect. The study of VEs protein profile from drug–sensitive and –resistant tumor cells allows a better understanding of the mechanisms of this transfer. Therefore, this work focused on the investigation of the possible roles of EVs and their proteins in the resistance intercellular transfer between CDDP–resistant and –sensitive lung adenocarcinoma human cells. Cell subline with resistance (RA-A549) was established, exposing the A549 line to CDDP concentrations. After, transwell co-cultures were performed between RA-A549 cells with A549 cells to verify EVs cell uptake and to assess the resistance transfer between the lines. In the transfer assay, A549 cells were co-cultivated with the A549 cells or RA-A549 with CDDP or not by 72 h and thereafter labeled with FDA. The EVs were isolated from culture supernatant by the differential centrifugation and ultracentrifugation method and analyzed by different techniques. The isolated EVs protein from RA-A549 and A549 were analyzed by LC-MS/MS. The RA-A549 subline showed IC50 value greater than of A549 line (about 4.5 fold). A549 cells co-cultivated with RA-A549 were able to RA-A549 EVs uptake and showed a lower sensitivity to CDDP (p < 0,001), suggesting chemoresistance intercellular transfer. The isolated EVs showed a variable diameter (10-420 nm) with a predominance of ~100 nm, and their presence was further confirmed by detection of CD63 protein. Two hundred and twenty-five different proteins were identified in the A549 and RA-A549 cell EVs, among these EVs classic protein markers, such as CD9, CD8, Alix, annexins, Rab GTPases e HSPs. Proteins were identified in the EVs potentially involved in the CDDP-resistance transfer and associated with cell proliferation and adhesion, drug flow blockage, cell invasion and migration, apoptosis evasion, attenuation of immune system and coagulation, angiogenesis, cell cycle regulation, DNA repair, modulation of energy metabolism, efflux or neutralization of the drug, protein degradation, reorganization of the tumor cell structure and shape.