Caracterização funcional do gene VviAgl11 durante a morfogênese da semente em videira e seu potencial uso biotecnológico

Abstract

A ausência de semente em videira, também chamada de apirenia, é amplamente apreciada pelo mercado consumidor de uvas de mesa. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam a morfogênese da semente não são totalmente compreendidos. Por este trabalho, buscou-se caracterizar funcionalmente o gene candidato VviAGL11, avaliando seu papel na morfogênese de sementes de Vitis vinifera. Dados prévios permitiram determinar o padrão de expressão de VviAGL11 na camada da endotesta da casca da semente, que precisa alongar e aumentar o número de células para que haja a lignificação e a determinação do tamanho final da semente. No presente estudo, a função de VviAGL11 foi avaliada por meio de sua expressão ectópica no mutante de seedstick (AGL11) de Arabidopsis thaliana, o que restaurou o fenótipo e confirmou o papel direto deste gene no desenvolvimento da semente, sugerindo que a depleção de sua expressão é responsável pelo desenvolvimento errôneo da camada de endotesta da semente, culminando no fenótipo de apirenia típico. Além disso, a função de VviAGL11 foi avaliada em videira com o uso de plasmídeos vegetais. Os resultados permitiram demonstrar que a alta expressão de VviAGL11 na cultivar apirênica Linda, após tratamento, está relacionada com a presença de pequenas sementes que não foram encontradas nas amostras-controle não tratadas Além disso, cachos de ‘Italia’ e ‘Ruby’ tratados com o plasmídeo de silenciamento VviAGL11 mostraram diminuição da expressão desse gene, número reduzido de sementes e aumento do número de traços de sementes. Em conjunto, os resultados confirmam que VviAGL11 é um importante regulador da morfogênese de sementes em videira. Em adição, populações segregantes para ausência de sementes foram testadas com cinco marcadores SSR, dos quais três marcadores microssatélites mostraram-se relacionados à ausência de sementes e poderiam ser usados com 100% de eficiência em um haplótipo para seleção assistida. Ao mesmo tempo, nove marcadores do tipo SNPs e INDELs foram desenvolvidos com base na sequência do alelo de VviAGL11 associado à ausência de sementes em V. vinifera. Para os marcadores VvAGL11_KASP_2, VvAGL11_KASP_3, VvAGL11_KASP_8 e VvAGL11_KASP_9, polimorfismos foram observados segregando em indivíduos apirênicos genotipados, confirmando sua associação com a ausência de sementes e sugerindo seu uso na estratégia de seleção assistida rápida e eficaz de videiras apirênicas.

Grapevine seedlessness, also known as apyreny, is widely appreciated by the table grape’s market. Nevertheless, the molecular mechanisms that control seed morphogenesis are not fully understood. This study aimed to characterize the function of the candidate gene VviAGL11, evaluating its role in Vitis vinifera seed morphogenesis. Previous data allowed us to determine the VviAGL11 expression pattern in the endotesta layer of the seed coat, which needs to elongate and increase in cell number to accomplish seed lignification and final seed size. In the present study VviAGL11 function was evaluated by its ectopic expression in Arabidopsis thaliana seedstick (AGL11) mutant background, which restored the phenotype and confirmed the direct role of this gene in seed development, suggesting that depletion of its expression is responsible for the erroneous development of the endotesta layer of the seed, therefore culminating in the typical seedless phenotype. Furthermore, we evaluated VviAGL11 function in grapevine with the use of plant plasmids. The results showed that a high expression of VviAGL11 in the seedless cultivar Linda, after treatment, was related with the presence of small seeds that were not found in untreated control samples Additionally, seeded ‘Italia’ and ‘Ruby’ bunches treated with a VviAGL11-silencing plasmid showed decreased gene expression, reduced number of seeds and increased number of seed traces. Taken together, the results confirm that VviAGL11 is a key master regulator of seed morphogenesis in grapevine. Moreover, segregating populations for seedlessness were tested with five SSR markers of which three microsatellite markers were proven to be related with seedlessness and could be used with 100% efficiency in a haplotype for assisted selection. Additionally, nine unique SNPs and INDELs markers were developed based on VviAGL11 allele associated with the absence of seeds in V. vinifera. For the markers VvAGL11_KASP_2, VvAGL11_KASP_3, VvAGL11_KASP_8 and VvAGL11_KASP_9, polymorphisms were observed segregating in genotyped seedless individuals, confirming their seedlessness association and suggesting their use in fast and effective assisted selection strategy for seedlessness grapevines.