Estrutura e dinâmica de oligossacariltransferases procarióticas

Abstract

A N-glicosilação é uma modificação distribuída de forma abundante nos domínios da vida, e é caracterizada pelo reconhecimento de uma assinatura N-X-S/T nas proteínas-alvo. O último passo dessa via biossintética é a transferência em bloco da cadeia glicídica para a asparagina da assinatura de N-glicosilação, sendo realizada pelas oligossacariltransferases (OSTs) PglB (Bacteria), AglB (Archaea) e STT3 (Eukarya). Dados cristalográficos para essas enzimas identificaram suas divisões em subunidades estruturais, como o núcleo central (CC), a sequência inserida (IS) e a periferia (P1 e P2). A unidade CC é fundamental para a interação com o substrato e a catálise, enquanto hipóteses da literatura sugerem que as outras unidades são importantes para a estabilidade estrutural das OSTs. Em decorrência do emprego desses sistemas enzimáticos em glicoengenharia de proteínas e no desenvolvimento de vacinas, a compreensão da origem estrutural para suas propriedades catalíticas e para a seletividade por substratos pode contribuir diretamente para o desenvolvimento de novas aplicações tecnológicas. Nesse âmbito, a presente tese avalia aspectos estruturais e conformacionais das OSTs, assim como a potencial função de suas unidades estruturais. Para tanto, empregamos a técnica de dinâmica molecular nas duas OSTs caracterizadas até o momento: a PglB de Campylobacter lari e a AglB de Archaeoglobus fulgidus. Desta forma, observamos a plasticidade conformacional do sítio ativo da PglB, com variações em elementos importantes, como a alça externa 5(EL5) e os resíduos catalíticos, sob influência da complexação dos substratos. Verificamos ainda que interações com as N-acetilações da glicana podem influenciar na seletividade desse substrato. Quanto à AglB, obtivemos evidências estruturais para propostas prévias da literatura de um papel termoestabilizador das unidades IS e P1 em relação à unidade CC. Nesse sentido, a presente tese esclareceu importantes aspectos estruturais e funcionais de OSTs, oferecendo suporte para o planejamento de novos experimentos e de aplicações tecnológicas. As novas informações sobre o mecanismo de seletividade da PglB podem auxiliar no desenvolvimento de glicoproteínas portando monossacarídeos específicos, potencialmente úteis para a produção de vacinas e de biomoléculas com uso terapêutico.

N-glycosylation is a modification broadly distributed in all domains of life. It is characterized by a sequence motif N-X-S/T in proteins that portray this glycan chain. The last step of the oligosaccharide biosynthetic pathway is the en bloc transfer of the glycan chain to the Asn from the motif. This reactions is performed by enzimes named oligosaccharyltransferases PglB (Bacteria), AglB (Archaea), and STT3 (Eukarya). Previous crystallography data identified subdivisions in the OST domains, such as the central core (CC), the inserted sequence (IS), and the peripheries (P1 and P2). CC unit is essential to the interaction with substrates and catalysis. Hypothesis from the literature suggests that the other units are important for structural stability of OSTs. The N-glycosylation systems are being employed in studies regarding glycoengineering, and vaccine development, therefore, the comprehension of structural aspects that explains the catalytic properties, as well as substrate selectivity of OSTs, may contribute directly to the development of novel technological applications. In this context, this thesis evaluates the structural behavior of OSTs which involves the dynamics of conformational states, as well as the impact caused by the deletion of structural units, aiming to infer the function of these regions. To achieve these goals, molecular dynamics simulations were performed using both OSTs characterized until now: PglB from Campylobacter lari and AglB from Archaeoglobus fulgidus. Analyzing data generated by PglB simulations, it was possible to observe the conformational plasticity of the PglB active site, with variation of important elements, such as the external loop 5 (EL5) and the catalytic residues, when in the presence of different substrates. Regarding AglB data, we obtained structural eveidences for the previously proposed thermostabilizing role displayed by IS and P1 units. In this manner, the present thesis clarified important structural and functional aspects of OSTs, offering support for new experiments and for technological applications. The new information about PglB selectivity mechanism could provide a basis for the development of glycoproteins possessing specific monosaccharides, potentially useful for the production of vaccines and therapeutical biomolecules.