Alteração de permeabilidade encefálica e efeito protetor do resveratrol sobre alterações no perfil de aquaporinas no modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao ácido valproico

Abstract

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é uma desordem do neurodesenvolvimento caracterizada, segundo o DSM-V, por uma díade comportamental: déficits de comunicação e interação social além de comportamentos repetitivos ou estereotipados. Uma observação de extrema importância na clínica é a de maior volume encefálico nos primeiros anos de vida do paciente com TEA, sendo esse aumento revertido ao longo da vida, tendo normalizado já no início da adolescência. Porém, durante o desenvolvimento é frequente uma maior permeabilidade de barreiras neurais. Apesar da etiologia do autismo ser desconhecida, tanto fatores genéticos quanto ambientais já foram associados à desordem, incluindo a utilização de ácido valproico (VPA) durante a gestação. Por isso, nosso grupo tem utilizado um modelo animal de autismo induzido pela exposição pré-natal ao VPA. Por meio desse modelo, demonstramos que o tratamento pré-natal com resveratrol (RSV) foi capaz de prevenir comportamentos do tipo autista na prole do grupo VPA. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a permeabilidade de barreiras encefálicas e a expressão e localização de aquaporina (AQP) 1, 4 e 9 em diferentes regiões do Sistema Nervoso Central (SNC) em modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao VPA. A obtenção dos animais passou por um processo inicial de acasalamentos, onde a confirmação da fecundação foi através da identificação de espermatozoides no líquido vaginal na manhã posterior ao pareamento. O modelo animal foi obtido através de uma única injeção intraperitoneal de VPA (600mg/kg) no E12,5 nas fêmeas prenhes. O tratamento com RSV (3,6 mg/Kg) ocorreu dos dias E6,5 ao E18,5 via subcutânea. Para a obtenção do material biológico dos filhotes machos com 30 dias, diferentes procedimentos foram realizados, de acordo com cada técnica, mediante preceitos éticos de experimentação animal para obtenção do tecido a fresco e para fixação com paraformaldeído 4%. No ensaio de permeabilidade de barreira, os animais do grupo VPA apresentaram maior entrada do corante azul de Evans nas regiões do plexo coroide e na área somatossensorial. Na análise da expressão proteica por western blotting, o grupo VPA apresentou diminuição de AQP1 e aumento de AQP4 na área somatossensorial e diminuição da AQP9 na região da amígdala, sendo só o aumento de AQP4 prevenido pelo tratamento com RSV. Com a técnica de imunofluorescência, observou-se diminuição somente na marcação da AQP1 no plexo coroide, juntamente com alteração morfológica dessa estrutura em ambos os grupos que receberam VPA. Esses resultados de maior permeabilidade e de alteração em AQP corroboram com os dados clínicos de edema e de maior volume encefálico descritos na literatura. Os mecanismos envolvendo esse perfil de expressão alterado no contexto do TEA ainda permanecem desconhecidos. Podemos concluir com o presente trabalho que os animais do grupo VPA possuem maior marcação do corante azul de Evans e alteração na expressão proteica de AQP em diferentes regiões do SNC, indicando possíveis alterações na permeabilidade encefálica no modelo animal de autismo.

Autistic Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by a behavioral dyad: communication and social interaction deficits, as repetitive or stereotyped behaviors. A clinical observation of extreme importance is the greater encephalic volume early in life of ASD patients, being this reverted throughout and normalized in the beginning of the adolescence. However, during development a greater permeability of neural barriers is frequent. Although the etiology of autism is unknown, both genetic and environmental factors have been associated with the disorder, including use of valproic acid (VPA) during gestation. Therefore, our group has used an animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA. By this model, we demonstrated that prenatal treatment with resveratrol (RSV) was able to prevent autistic behaviors in offspring of VPA animals. The aim of the present study was to evaluate the permeability of brain barriers and the expression and location of aquaporin (AQP) 1, 4 and 9 in different regions of the Central Nervous System (CNS) in animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA. Animals were mated overnight and the fertilization was confirmed by the identification of spermatozoa in the vaginal fluid in the next morning after the pairing. The animal model of autism was induced by a single intraperitoneal injection of VPA (600mg/kg) at E12.5 in pregnant females. Treatment with RSV (3.6 mg/kg) occurred from days E6.5 to E18.5 subcutaneously. In order to obtain the biological samples of 30-day-old male offspring, different procedures were performed according to each technique, using ethical precepts of animal experimentation to obtain fresh tissue and for fixation with 4% paraformaldehyde. In the barrier permeability assay, animals of the VPA group showed increased Evans blue dye labeling in choroid plexus and somatosensory area. In the Western blotting protein expression analyses, the VPA group showed decreased AQP1 and increased AQP4 in somatosensory area and decreased AQP9 in amygdala region, but the RSV treatment was able to prevent only the increase in AQP4 levels. According immunofluorescence assay, only the AQP1 labeling was observed in choroid plexus, together with morphological alteration of this structure in VPA-exposed animals. These results of increased permeability and alteration in aquaporins levels corroborate the clinical data of edema and of larger encephalic volume described in the literature. However, mechanisms involving this altered expression profile in the context of ASD remain unknown. We conclude with the present work that the animals of the VPA group presented an increased Evans blue dye labeling and alteration in protein expression of aquaporins in different regions of the CNS, indicating possible alterations in brain permeability in animal model of autism.