Enriquecimento ambiental em peixe-zebra : perfil comportamental e envolvimento do sistema glutamatérgico

Abstract

O enriquecimento ambiental oferece estímulos sensoriais, sociais e cognitivos possibilitando ao animal bem-estar e comportamentos mais próximos ao seu natural. Alterações ambientais podem gerar mudanças de expressão gênica, bem como de comportamento. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de diferentes protocolos de enriquecimento ambiental sobre o perfil comportamental do peixe-zebra (Danio rerio) adulto. Utilizando pedras ao fundo do aquário, plantas artificiais e os animais em cardume, foram montados três protocolos de enriquecimento ambiental. O “Protocolo 1” foi desenhado para avaliar se um ambiente enriquecido com os componentes básicos de complexidade por sete dias já induziria alterações no comportamento do peixe-zebra. Os resultados obtidos com o teste de open tank demonstraram que os animais do grupo ambiente enriquecido (AE) apresentaram um perfil locomotor diferenciado, com redução de distância percorrida total e velocidade média, quando comparado com animais do grupo ambiente padrão (AP). Entretanto, esta diferença se deve a uma instabilidade comportamental apresentada pelo grupo AP através do aumento de distância percorrida no fundo do aquário. Não foram observadas alterações no comportamento tipo ansiedade e preferência social entre os grupos. Desse modo, desenhamos o “Protocolo 2” a fim de avaliar se a reposta comportamental se manteria durante uma exposição mais longa (quatorze dias) ao enriquecimento ambiental. Entretanto, a diferença no perfil locomotor entre os grupos não foi apresentada neste protocolo. Com esses resultados, demonstrou-se a intensidade do estresse provocado pela simples troca entre aquários idênticos utilizados normalmente em biotérios, necessitando uma ambientação mínima de duas semanas no aquário moradia antes da realização de testes comportamentais Por último, realizamos a avaliação do “Protocolo 3”, com o intuito de estudar se a renovação de itens da complexidade do enriquecimento ambiental dentro do período quatorze dias teria alteração nos resultados já observados. Os animais do grupo AE não apresentaram diferença no perfil comportamental geral mesmo com a inserção de novos objetos, entretanto, houve uma redução de distância percorrida no fundo do aparato. Em peixe-zebra, estudos já demonstraram a indução da plasticidade neuronal e aumento na proliferação neuronal quando submetidos a protocolos de enriquecimento. No modelo de roedores, muitos dos efeitos do enriquecimento ambiental são relacionados ao aumento de neurogênese adulta e de ramificação dendrítica, bem como alteração da funcionalidade de alguns sistemas de neurotransmissores, como o glutamatérgico. Assim, a segunda parte dessa dissertação teve como objetivo a análise da expressão proteica de um dos transportadores vesiculares de glutamato, o vGluT2, em animais expostos aos protocolos citados anteriormente Os vGluTs são expressos em regiões dendríticas dos neurônios e quanto maior sua expressão proteica, maior é a densidade de vesículas sinápticas presentes. Os dados obtidos demonstram que essa resposta é relacionada a consolidação e habituação dos peixes a essa condição por um período mais prolongado no protocolo de enriquecimento ambiental (Protocolo 2). Neste trabalho, foi demonstrado que o protocolo de enriquecimento ambiental altera a resposta comportamental do peixe-zebra adulto, mantendo-a mais regular do que a dos controles e isso, provavelmente, é decorrente da estimulação de processos direcionados a resposta ao estresse da novidade, bem como de vias relacionadas com a adaptabilidade. Ademais, demonstramos que a habituação por um protocolo mais longo à condição de um ambiente enriquecido é mais importante para desencadear o aumento de expressão proteica de vGluT2 em cérebro de peixe-zebra.

Environmental enrichment offers social, sensory and cognitive stimuli making possible animal welfare and behavior closer to its natural. Environmental alterations can generate changes in gene expression as well as in behavior. Thus, first aim of this study was to evaluate the influence of different environmental enrichment protocols in adult zebrafish’s (Danio rerio) behavioral profile. Considering items more commonly described in the literature (stones at tank bottom, artificial plants and shoal), we designed three enriched environment protocols. “Protocol 1” was developed to evaluate if an enriched environment with basics components of complexity for seven days already induce behavior alterations in zebrafish. Results obtained with open tank test demonstrated that animals submitted to environmental enrichment (EE) presented differentiated locomotor profile by a reduction of total distance travelled and average speed when compared with animals in the standard environment (SE). However, this difference was due to a behavioral instability presented by animals of SE group reflected in an increase of distance travelled in last two minutes of the test. There were not alterations in anxiety-like behavior and social preference between the groups. In this way, the “Protocol 2” was designed to evaluate whether these behavioral responses in open tank test remain in a longer exposure (fourteen days) to environmental enrichment. However, the difference in locomotor profile was not significant between groups. With the results of these two first protocols, the intensity of stress provoked by a simple change of equal tanks, normally utilized in facilities, was demonstrated. This also presented the necessity of a minimum of two weeks of habituation in home tank, before conducting any behavioral test Finally, we realized the evaluation of “Protocol 3” in order to study if a renovation of enriched environment items of complexity within the period of fourteen days would change results already observed. Animals of EE group showed no difference in general behavioral profile even with the insertion of new objects in environment, similarly to that observed in Protocol 2, however a reduction of distance travelled was presented by these animals, reflecting a little of Protocol 1. In zebrafish, some studies have already demonstrated the induction of neuronal plasticity and increase of neuronal proliferation when animals were submitted to enriched environment protocols. In rodent models, many of effects of environmental enrichment are related to increased adult neurogenesis and dendritic branching, as well as alteration of functionality of some neurotransmitter system was known – like glutamatergic. Thus, second part of this dissertation had as objective the analyses of protein expression of one of the vesicular glutamate transporter (vGluT), the vGluT2, in those three enriched environment protocols cited previously by Western Blotting technique The vGluTs were expressed in neuronal dendritic regions and more its expression, more density of synaptic vesicles presents in analyzed region. Data obtained demonstrated that the increase of immunocontent of vGluT2 is related with consolidation and habituation of fish to this condition for a longer period in environmental enrichment (Protocol 2). In this study, there was demonstrated that environmental enrichment alters the adult zebrafish’s behavioral response, keeping it more regular than the control group (SE) and, probably, this is due to stimulation of process directed to stress response of novelty as well as of pathways related to adaptability. In addition, we have demonstrated that habituation to the condition by a longer protocol of enriched environment is more important to trigger the increase of vGluT2 protein expression in total brain of adult zebrafish.