Identificação de resistência a antimicrobianos presente na microbiota de pinguins Pygoscelis antarcticus, P. papua e Spheniscus magellanicus

Abstract

As populações de aves antárticas têm sido estudadas e consideradas indicadoras da qualidade do ecossistema marinho, especialmente dos oceanos do sul, ao longo dos últimos 50 anos. Existem cerca de 40 espécies de aves marinhas que se reproduzem em áreas descobertas de gelo. Dentre as aves marinhas antárticas, os pinguins são os que têm a maior representatividade ecológica e são considerados espécies sentinelas para o estudo das mudanças ambientais nesse continente. Esses animais representam 90% da biomassa de aves nos oceanos do sul, e suas colônias estão distribuídas nas ilhas antárticas e subantárticas bem como sobre o Continente Antártico. Há três espécies de pigoscelídeos mais representativos desta biomassa, são eles: Pygoscelis papua (Pinguim gentoo), Pygoscelis adeliae (Pinguim-de-adélia) e Pygoscelis antarcticus (Pinguim-de-barbicha). Os pinguins antárticos estão entre as aves de menor contato com humanos, o que os torna possíveis indicadores da presença natural de genes de resistência a antimicrobianos na microbiota intestinal de aves e no ambiente. O objetivo desta dissertação foi avaliar a presença de resistência a antimicrobianos na microbiota intestinal de P. antarcticus e de P. papua, e compará-las à microbiota de Spheniscus magellanicus (pinguins-de-magalhães). Os S. magellanicus habitam a Argentina, Chile e Ilhas Malvinas, locais em que há variadas atividades humanas. Foram coletadas amostras de fezes aparentemente frescas de 46 pinguins P.antarcticus e de 12 pinguins P. papua, nas suas respectivas colônias na Ilha Elefante, em dezembro de 2014. De S. magellanicus foram coletadas, com auxílio de suabes cloacais, amostras de 19 indivíduos, encontrados na costa norte do Rio Grande do Sul, de Quintão a Torres, durante os meses de inverno de 2015 e de 2016. As amostras de microbiota dos pinguins foram cultivadas em ágar LB e os isolados bacterianos foram triados para os seguintes antimicrobianos: eritromicina (≥ 8μg/mL), estreptomicina (≥ 2.000 μg/mL), tetraciclina (≥ 16 μg/mL) e vancomicina (≥ 32 μg/mL). Em 10 amostras de P. antarcticus e em 15 amostras de S. magellanicus foram identificadas bactérias resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos testados. Todas as amostras de P. papua foram sensíveis a esses antimicrobianos. As espécies dos isolados resistentes foram identificadas pelo sequenciamento do rRNA 16S, que revelou sete gêneros, sendo os mais recorrentes Enterococcus sp. e Staphylococcus sp. Esses isolados resistentes também foram triados para a presença de genes de resistência aos antimicrobianos. O tet(M) foi mais abundante em S. magellanicus (5) do que em P. antarcticus (3), ao passo que o int e van(B) foram identificados somente em P. antarcticus (três e um, respectivamente). O gene erm(B) não foi encontrado em nenhum dos isolados. Uma vez que a fração não cultivável das fezes também pode apresentar genes de resistência, foi realizada a extração do DNA das fezes de pinguins antárticos para obtermos DNA de todos os micro-organismos presentes. Os genes mais recorrentes nas amostras de DNA total das fezes de P. antarcticus e P. papua foram, respectivamente, int (5 e 7), seguido de tet(M) (1 e 5). O van(B) foi encontrado em amostras das duas espécies de pinguins, enquanto que o erm(B) foi encontrado somente nas amostras de P. papua. De acordo com esses resultados, houve mais resistência a antimicrobianos na fração cultivável da microbiota de pinguins-de-magalhães do que em pinguins antárticos. Na fração não-cultivável, foram encontrados mais genes de resistência nas amostras de P. papua do que de P. antarcticus.

Antarctic seabird populations have been studied as bioindicators of the nature variability in the Southern Ocean marine ecosystems over the last 50 years. Among the Antarctic seabirds, the most representative species are penguins; they represent 90% of total biomass of birds in the Southern Ocean, and are considered sentinels for environmental changes in the Antarctic region. Pygoscelis antarcticus and P. papua are the most prevalent species in Antarctida. Because they remain among the wild birds with least contact with humans, their microbiota may serve as indicators of antimicrobial resistance in the environment. The aim of this work was to evaluate the antimicrobial resistance present in the microbiota of P. antarcticus and P. papua, and compare it with the microbiota of Spheniscus magellanicus (Magellanicus penguins). Magellanicus penguins inhabit Argentina, Chile and Falkland Islands, and therefore have more contact with humans. We have collected samples of apparently fresh feces from P. antarcticus (n = 46) and from P. papua (n = 12) in their respective colonies located in the Elephant Island in December 2014. From S. magellanicus, we have collected cloacal swabs (n = 19) from specimens found in the northern coast of Rio Grande do Sul, from Quintão to Torres, during the winter months of 2015 and 2016. All samples were evaluated for the presence of resistant bacteria to the following antimicrobials: erythromycin (≥ 8μg/mL), streptomycin (≥ 2.000 μg/mL), tetracycline ( ≥ 16 μg/mL) and vancomycin (32 μg/mL). We have isolated resistant bacteria from 10 samples of P. antarcticus and from 15 samples of S. magellanicus; there was no bacterial growth in the presence of any of these antimicrobials from samples of P. papua feces. The species of resistant bacteria were identified by 16S rRNA sequencing: among the 7 genera identified, the most frequent were Enterococcus sp. and Staphylococcus sp. Resistant bacteria were screened for the resistance genes ermB, tet(M), int and van(B). tet(M) was more frequent in S. magellanicus (5) than in P. antarcticus (3), while int and van(B) were identified only in P. antarcticus (3 and 1, respectively). The erm(B) gene was not identified in any isolate. Considering that the non-cultivable fraction from feces can also harbor resistance genes, we extracted DNA from feces of the Antarctic penguins in a attempt to obtain DNA from all micro-organisms of their microbiota. The most abundant genes present in the microbiota of P. antarcticus and P. papua were, respectively: int (5 and 7) and tet (M) (1 and 5). The van(B) gene was found in one sample of each species, while erm(B) was found in only one sample of P. papua. According to our results, antimicrobial resistance is more frequent in the cultivable microbiota of S. magellanicus than of P. antarcticus. In the non-cultivable fraction, resistance genes were more frequent in samples from P. papua than from P. antarcticus.