Análise de impurezas orgânicas no cloridrato de besifloxacino por cromatografia líquida de alta eficiência com eluição isocrática e gradiente

Abstract

A análise de impurezas é uma etapa importante no controle de qualidade do insumo farmacêutico e do produto final. Provenientes da síntese do medicamento ou dos excipientes, mesmo em pequenas concentrações, as impurezas podem afetar a eficácia e a segurança. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados dois métodos empregando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para a avaliação do besifloxacino e sua impureza de síntese, um com eluição isocrática e outro com eluição gradiente. As análises por CLAE com modo de eluição isocrática foram executadas utilizando coluna Ciano, mantida a 25 °C. A fase móvel foi constituída por 0,5% de trietilamina (pH 3,0) : acetonitrila (88:12 v/v), eluída na vazão de 1,0 mL/min com detecção a 330 nm. O método com eluição gradiente foi conduzido com a mesma coluna e componentes da fase móvel modificando apenas as proporções entre fase orgânica e aquosa durante as análises. Os procedimentos foram validados de acordo com guias aceitos internacionalmente, observando-se resultados dentro dos limites aceitáveis. Os métodos apresentaram-se lineares na faixa de 140 a 260 μg/mL para o besifloxacino e de 0,3 a 2,3 μg/mL para a impureza A. Com volume de injeção de 20 μL, os limites de detecção e quantificação foram, respectivamente, 0,07 e 0,3 μg/mL. A precisão foi alcançada para todas as análises realizadas, obtendo DPR inter-dia igual a 6,47 e 6,36 para a impureza A com eluição isocrática e gradiente, respectivamente. A exatidão foi superior a 99% e a robustez apresentou resultados satisfatórios. No método isocrático obteve-se tempo de análise de 25 min e no gradiente de 15 min. O número de pratos teóricos no modo isocrático foi na ordem de 5000 enquanto no modo gradiente foi na ordem de 45000, ou seja, obteve-se maior eficiência da coluna com alteração da composição da fase móvel durante a eluição. No insumo besifloxacino e no produto farmacêutico utilizados neste trabalho, impurezas relacionadas estavam presentes, mas a impureza A não foi detectada. Os métodos propostos, considerando-se o limite de quantificação, podem ser aplicados na determinação quantitativa da impureza A na análise da matéria prima do besifloxacino, assim como na suspensão oftálmica.

Analysis of impurities is an important step in quality control of pharmaceutical ingredients and final products. From drug synthesis or excipients, even in small concentrations, impurities may affect efficacy and safety. In the present study two chromatographic methods were developed and validated for high-performance liquid chromatography (HPLC) for the assessment of besifloxacin and its synthesis impurity, one with isocratic and another with gradient elution. Analyses by HPLC in isocratic elution mode were performed using Cyano column maintained at 25 °C. Mobile phase was composed of 0.5% triethylamine (pH 3.0): acetonitrile (88:12 v/v) eluted at a flow rate of 1.0 ml/min with detection at 330 nm. The method with gradient elution was carried out with the same column and mobile phase components modifying only proportion between organic and aqueous phase during analysis. The procedures have been validated according to internationally accepted guidelines, obtaining results within acceptable limits. The methods presented a linear response from 140-260 μg/mL for besifloxacin and from 0.3 to 2.3 mg/mL for impurity. With the injection volume of 20 μL, the limit od detection and limit of quantitation were, respectively, 0.07 and 0.3 μg/mL. Precision was achieved for all analyses, obtaining inter-day RSD equal to 6.47 and 6.36 for impurity A with isocratic and gradient elution, respectively. The accuracy was higher than 99% and robustness exhibited satisfactory results. In the isocratic method was obtained analysis time 25 min and 15 min gradient. The number of theoretical plates in the isocratic mode was of the order of 5000 while in the gradient mode was of the order of 45000, that is, gave greater efficiency of the column by changing the mobile phase composition during elution. In raw material of besifloxacin and pharmaceutical product used in this study, related impurities were present but the impurity A was not detected. The proposed methods, considering the limit of quantitation, can be in quantitative determination of impurity A in the analysis of besifloxacin raw material, as well as in ophthalmic suspension.