Estudos proteômicos do patógeno suíno Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.