Evolução molecular de proteases Pr1 (Classe II) de Metarhizium anisopliae

Abstract

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente.

The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.