Efeitos neuroprotetores do 4'-clorodiazepam em modelos experimentais de Doença de Alzheimer in vitro e sobre o desenvolvimento neuronal

Abstract

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas.

The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.