Caracterização funcional dos genes ASR na resposta ao alumínio em arroz (ORYZA SATIVA)

Abstract

O arroz é considerado o cereal mais tolerante ao alumínio (Al). Entretanto, a variabilidade entre os genótipos leva a uma considerável diferença quanto ao grau de tolerância para cultivares distintas. Diversos estudos mostram que plantas de arroz toleram o Al por intermédio de mecanismos internos e externos. Neste trabalho foi analisada a modulação da expressão da família gênica ASR (Aba, Stress and Ripening) em função do tratamento com Al. O gene ASR5 foi diferencialmente expresso em raízes de arroz tolerante ao Al (ssp Japonica cv Nipponbare). Entretanto, ASR5 não respondeu a exposição ao Al em raízes de arroz sensíveis ao Al (ssp Indica cv Taim). Plantas transgênicas silenciadas para os genes ASR apresentaram um aumento da sensibilidade ao Al. Calos embriogênicos de arroz transformados com a fusão ASR5-GFP revelaram que a proteína ASR5 localiza-se no núcelo e no citoplasma. Em protoplastos transformados, ASR5 localizou-se nos cloroplastos. Usando uma abordagem proteômica, comparando plantas não-transformadas e plantas ASR5_RNAi, um total de 41 proteínas com padrões contrastantes foi identificado. No intuito de identificar genes com expressão alterada pelo Al em arroz, e buscar genes afetados pelo silenciamento de ASR5, foi realizado o sequenciamento total dos transcritos utilizando plantas de arroz não transformadas e ASR5_RNAi em duas condições: controle e tratamento com Al. Essas análises transcriptômicas revelaram que 961 genes responderam ao Al em raízes de plantas de arroz não transgênicas submetidas ao Al. Nas plantas ASR5_RNAi, apenas 309 genes responderam ao tratamento com Al. Entretanto, apenas 52 desses genes se sobrepuseram quando comparados ao grupo de genes modulados em plantas não transformadas, sugerindo que a planta ASR5_RNAi perdeu a capacidade de regular um conjunto de genes. Além disso, análises de imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento em massa, revelaram que ASR5 liga-se ao promotor do gene STAR1, entre outros, regulando sua expressão em resposta ao Al. Os resultados mostram pela primeira vez que ASR5 atua como fator de transcrição em arroz e que está envolvido na regulação de genes responsivos ao Al conferindo tolerância frente à toxicidade do Al.

Among cereal crops, rice is considered the most aluminium (Al) tolerant species. However, variability among rice genotypes leads to remarkable differences in the degree of Al tolerance for distinct cultivars. A number of studies have demonstrated that rice plants achieve Al tolerance through internal and external mechanisms. We have analyzed expression changes of the rice ASR (Aba, Stress and Ripening) gene family as a function of Al treatment. The gene ASR5 was differentially regulated in the Al-tolerant rice ssp Japonica cv Nipponbare. However, ASR5 expression did not respond to Al exposure in Indica cv Taim rice roots, which are highly Al-sensitive. Transgenic plants carrying RNAi constructs that targeted the ASR genes displayed increased Al susceptibility in T1 plants. Rice embryogenic calli expressing an ASR5-GFP fusion revealed that ASR5 was localized in both the nucleus and cytoplasm. In transformed protoplasts, ASR5-GFP appears in chloroplast cells. Using a proteomic approach to compare non-transformed and ASR5_RNAi plants, a total of 41 proteins with contrasting expression patterns were identified. In order to identify genes with differential modulation under Al stress in rice, and search for genes affected by ASR5 silencing, RNA-seq was made in non-transformed plants and ASR5_RNAi plants in control conditions and after Al treatment. These analyses revealed that 961 genes responded to Al in non-transformed rice roots under Al stress. A total of 309 genes responded to Al in ASR5_RNAi plants. Only 52 genes overlapped between non transformed and ASR5_RNAi plants when comparing genes modulated by Al, showing that ASR-silenced plants lost the ability to modulate a set of genes in response to Al treatment. Furthermore, ChIP-Seq analysis revealed that ASR5 can bind to the promoter of STAR1, among other genes, regulating its expression under Al stress. These results show for the first time that ASR5 act as a transcription factor in rice and that it regulates Al-responsive genes conferring tolerance in rice against Al toxicity.