Análise do padrão de expressão dos genes CHIT1, CHI2 e CHI3 que codificam quitinases no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

Abstract

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um agente biocontrolador capaz de infectar uma grande variedade de pragas. O controle biológico de carrapatos e insetos tem sido empregado principalmente porque, ao contrário dos pesticidas químicos, não agridem o meio ambiente, não apresentam toxidez e normalmente não induzem resistência nos hospedeiros. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa sendo que a cutícula constitui a principal barreira. A quitina é um dos componentes majoritários da cutícula de artrópodes, e os fungos entomopatogênicos secretam uma grande quantidade de quitinases. Alguns genes de quitinases de M. anisopliae têm sido estudados pelo nosso grupo de pesquisa, dentre eles estão os genes chit1, chi2 e chi3. Objetivando contribuir na elucidação da função dos genes que codificam quitinases na biologia de M. anisopliae, analisamos o padrão de transcrição dos genes chit1, chi2 e chi3 em diferentes tempos e condições de cultivo, assim como acompanhamos a produção de quitinases e o consumo de açúcares nos sobrenadantes destes cultivos. Foram realizados cultivos com a adição de diferentes fontes de carbono: glicose 1%; N-acetilglicosamina (NacGlc) 0,25% e 1%; quitina cristalina 1%; cutícula de carrapato Boophilus microplus 1% e cutícula de Dysdercus peruvianus; nos seguintes tempos de cultivo: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 e 72 horas. Para analisar os níveis de transcritos dos genes chit1, chi2 e chi3 da linhagem E6, foi utilizada a metodologia de RT-PCR, tendo como controle interno da reação e da quantidade de RNA a amplificação do gene tef-1α de M. anisopliae, descrito como tendo expressão constitutiva. O gene chit1, em todas as fontes de carbono analizadas, apresentou aumento da transcrição desde o tempo inicial dos cultivos, aumentando, na maioria das vezes, a partir de 40 horas de cultivo. Para os genes chi2 e chi3, foi observada a presença de transcritos parcialmente processados, além dos transcritos completamente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi2 mostrou-se variável nas diferentes fontes de carbono. Os transcritos apresentaram aumento gradativo com o aumento do tempo de cultivo, com exceção dos cultivos em glicose.Em relaçãoao gene chi3, com exceção dos cultivos em quitina cristalina, todas as condições apresentam as duas espécies de transcrito, completamente e parcialmente processados. O perfil de transcrição observado para o gene chi3 é muito variado sugerindo uma regulação complexa.

The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is a biological control agent that infects a variety of plagues. The biological control of ticks and insects has been used to overcome the deleterious effects of chemical pesticides. The biological control produce less effects to the environment, has low toxicity and normaly does not induce host resistance. M. anisopliae penetrates its hosts actively through the cuticle which consists the main barrier to infection. Chitin is one of the main components of arthropod cuticle and, the entomopathogenic fungi secret large amounts of chitinases. Some chitinase genes of M. anisopliae have been studied by our group; amongst them are chit1, chi2 and chi3 genes. In order to contribute to the elucidation of the function of the chitinase genes in the biology of M. anisopliae, we analyzed the levels of transcripts of the chit1, chi2 and chi3 genes in different growth times and culture conditions. The secretion of chitinases and the consumption of sugars were also analysed in the cultures. Different carbon sources were used as: 1% glucose; 0.25% and 1% N-acetylglucosamine (NacGlc); 1% chitin; 1% Boophilus microplus cuticle; and 1% Dysdercus peruvianus cuticle. Culture times analysed were: 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 and 72 hours. The level of transcripts were analysed by using RT-PCR profiles of chit1, chi2 and chi3 genes of E6 strain. The constitutively expressed tef-1α gene from M. anisopliae was used as RNA loading control. The chit1 gene transcripts, in all carbon sources analysed increased with the culture time. For chi2 and chi3 transcripts partial and complete processing forms were detected. The chi2 transcription profile was very variable. The transcripts presented a gradual increase, in the different times and carbon sources, but not for glucose added cultures. For the chi3 gene transcripts, with the exception of chitin added cultures, in all carbon sources presented both the partial and complete processed transcripts. The chi3 transcription profile was also very variable, suggesting a complex regulation.