Propriedades estruturais e biológicas do peptídeo Jaburetox e da proteína de fusão Glutationa S-Transferase-Urease Ubíqua de soja (Glycine max)

Abstract

Urease (EC 3.5.1.5) é uma metaloenzima dependente de níquel que catalisa a hidrólise da ureia à amônia e dióxido de carbono. A Soja (Glycine max) produz duas isoformas de urease: a urease ubíqua (uSBU) e a urease embrião-específica (eSBU). Nosso grupo demonstrou que eSBU apresenta propriedades biológicas independentes da sua atividade ureolítica, como ativação de plaquetas, atividade inseticida e inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos, estes últimos sugestivos de envolvimento das SBUs em mecanismos de defesa da planta. Outras ureases também estudadas pelo nosso grupo, são as de Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis). O Feijão-de-porco produz três isoformas de urease: Canatoxina, JBU e JBURE-II, que também apresentam atividades biológicas, não relacionadas à sua atividade enzimática. Dentre elas, a atividade inseticida tem sido a mais estudada. A toxicidade das ureases a insetos envolve a liberação de um peptídeo interno tóxico, mediante à hidrólise por enzimas digestivas do inseto. Um peptídeo equivalente foi clonado em Escherichia coli e denominado Jaburetox. Este peptídeo apresenta um amplo espectro de ação contra insetos e toxicidade contra fungos. Nossos objetivos nessa tese foram estudar: 1) as propriedades biológicas da urease ubíqua de soja, fusionada à Glutationa S-Transferase (GST-uSBU), e 2) as propriedades estruturais do peptídeo Jaburetox. No capítulo 1 mostramos que a GST-uSBU é tóxica contra fungos filamentosos, interferindo no metabolismo secundário fúngico e na produção de pigmentos, e também foi tóxica a leveduras, induzindo mudanças morfológicas. A proteína de fusão apresentou ainda atividade inseticida e induziu agregação de plaquetas de coelho e de hemócitos de insetos. Os dados sugerem que GST-uSBU serve de modelo para o estudos futuros de propriedades biológicas de ureases de plantas. No captítulo 2, o peptídeo Jaburetox foi estabilizado em sua forma monomérica, com a utilização do agente redutor TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). O Jaburetox apresentou elevado raio hidrodinâmico, característico de uma proteína intrinsicamente desordenada. Estes dados foram confirmados através de análises de Dicroísmo Circular, de preditores de desordem (PONDR) e por Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura do peptídeo em solução foi elucidada, apresentando um motivo α-hélice na região N-terminal e duas estruturas do tipo volta, uma na região central e outra próxima da região C-terminal do peptídeo. O conhecimento da estrutura tridimensional do peptídeo será de grande importância para o entendimento do mecanismo de ação inseticida e fungitóxico do Jaburetox.

Urease (EC 3.5.1.5) is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Soybean (Glycine max) produces two urease isoforms: ubiquitous urease (uSBU) and the embryo-specific urease (eSBU). Our group demonstrated that eSBU displays biological properties independent of its ureolytic activity, such as platelets activation, insecticidal activity and inhibition of phytopathogenic fungi growth. These data suggested that soybean ureases could be involved in plant defense. Other ureases also studied by our group are jack bean (Canavalia ensiformis) ureases. Jack bean produces three isoforms of ureases, Canatoxin, JBU and JBURE-II, which also have biological properties unrelated to enzymatic activity. Among them, the insecticidal activity has been the most studied. The toxicity of ureases against insects involves hydrolysis by insect digestive enzymes and the release of a toxic internal peptide. An equivalent peptide was cloned in Escherichia coli and called Jaburetox. This peptide presents a broad spectrum of activity against insects and is also fungitoxic. In this thesis, our objectives were to study: 1) the biological properties of the soybean ubiquitous urease fused to Glutathione S- Transferase (GST-uSBU), and 2) the structural properties of the peptide Jaburetox. In chapter 1, we show that GST-uSBU is toxic against filamentous fungi, interfering on the fungal secondary metabolism, in the pigments production, and also affected yeasts, inducing morphological changes. GST-uSBU also displayed insecticidal activity and induced aggregation of rabbit platelets and insect hemocytes. Thus, this fusion protein could serve as model for future studies related to biological properties on plant ureases. In chapter 2, the peptide Jaburetox was stabilized in its monomeric form by using the reducing agent TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Jaburetox showed a large hydrodynamic radius, which is characteristic of an intrinsically disordered protein. These data were confirmed by Circular Dichroism analysis, disorder predictors (PONDR) and Nuclear Magnetic Resonance. The structure of the peptide in solution was elucidated, showing a α-helix motif in the N-terminal region and two turn-like structures, one located in the central region and another near the C-terminal of the peptide. The knowledge of Jaburetox’s three-dimensional structure is an important step towards the understanding of its insectidal and fungitoxic mode of action.