Efeito não-clássico da testosterona e da epitestosterona em testículos de ratos neonatos

Abstract

A concentração intratesticular de andrógenos no período fetal e neonatal é elevada, entretanto as células de Sertoli não expressam o receptor intracelular de andrógenos (iAR). Assim, neste período as células de Sertoli não respondem aos andrógenos através dos mecanismos clássicos. A importância fisiológica da elevada concentração de andrógenos ainda não é compreendida, acredita-se ser em virtude de sua ação através de mecanismos não-clássicos. Os hormônios T (testosterona) e FSH atuam sinergicamente para aumentar a eficiência da espermatogênese, entretanto estudos mostram que o FSH bloqueia a fosforilação ERK mediada pela ação não-clássica da T. Este estudo teve por objetivos: avaliar a expressão de iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn; avaliar o efeito da T e da EpiT sobre a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn; avaliar o efeito da T sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn; e avaliar a interação entre os efeitos eletrofisiológicos da T e epitestosterona (EpiT) com o FSH em células de Sertoli de ratos no 14º dpn. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para a avaliação a imunorreatividade ao iAR (n=5 por grupo). Na técnica de captação de 45Ca2+ testículos inteiros de ratos no 4º dpn foram pré-incubados com 45Ca2+ por 60 minutos e incubados com T (1 μM) ou EpiT (1 μM) por 5 minutos (n=5 por grupo). O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Nos testículos de animais no 5º dpn foi realizada a aplicação de T (1 μM), n=4. Nos animais no 14º dpn foi realizada a aplicação de FSH (4 mU) seguida da aplicação de T (1 μM) ou e EpiT (1 μM), após 30 segundos (n=7 e 6, respectivamente); e EpiT (1μM) após 5 minutos (n=6). Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste T student para comparação entre dois grupos, ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni e teste de Friedmann, seguido do pós-teste de Dunn. Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA/UFRGS n° 22635. A imunorreação ao iAR foi observa nas células de Leydig e células peritubulares em todas as idades. Não foi observada marcação referente a iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn. T e EpiT estimularam a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn. A aplicação tópica de T promoveu a despolarização do potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 4º dpn. A aplicação de FSH seguida da aplicação de T e EpiT promoveu uma redução da reposta dos dois hormônios. Já aplicação de EpiT 5 minutos após a aplicação do FSH resultou em um retardo da despolarização promovida pela EpiT. A resistência da célula também foi reduzida, em comparação com a resistência da aplicação isolada da EpiT. Concluímos que: as células de Sertoli de ratos Wistar não expressam iAR no 4º e 5º dpn; T e EpiT atuam através do mecanismo de ação não clássico estimulado a captação de cálcio em testículos inteiros de ratos no 4º dpn; e a T produz um efeito despolarizante sobre a membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn similar ao já observado aos 15 dias. Este efeito não-clássico produzido pelos andrógenos é mediado por um receptor, ainda não identificado, localizado na membrana celular ou próximo a ela, estruturalmente diferente do iAR. A interação entre os efeitos do FSH e andrógenos sobre o potencial de membrana de células de Sertoli resulta na redução da resposta despolarizante desencadeada pelos hormônios.

The intratesticular testosterone concentration is high in the early postnatal period, but the intracellular androgen receptor expression is still absent in Sertoli cells. Thus, these cells do not respond to androgens, through classical mechanisms. The physiological importance of the high concentration of androgens in the testes is not fully understood, it is believed to be due to its action through non-classical mechanisms. Both FSH and T (testosterone) increase the spermatogenic efficiency, however studies show that FSH blocks testosterone-mediated activation of ERK mediated by non-classic action. This study aimed to evaluate iAR expression in Sertoli cells from Wistar rats on post-natal day (pnd) 4 and 5; the non-classical effects of testosterone and epitestosterone on calcium uptake and the electrophysiological effects of testosterone (1 μM) on Sertoli cells from rats on pdn 4 and 5 with lack of expression of intracellular androgen receptor (iAR), and evaluate the crosstalk on electrophysiological effects of testosterone and epitestosterone with FSH in Sertoli cells from rats on pnd 14. Immunohistochemistry was used to evaluate iAR immunoreactivity in Sertoli cells from Wistar rats (n = 5 each group). Calcium uptake was investigated using whole testes from rats on pdn 4. The testicular tissue was pre-incubated in Hank’s balanced salt solution (HBSS) with 45Ca2+ for 60 min (n=5 in each group). Then, testes were incubated in HBSS with 45Ca2+, with or without T (1 μM) or EpiT (1 μM) for five minutes. The membrane potential of Sertoli cells was recorded using a standard single microelectrode technique. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. T (1 μM) it was apply in testis of rats on pnd 5 (n=5). In animals on pnd 14 FSH (4 mU) injection was followed by the application of T (1 μM) or EpiT (1 μM) after 30 seconds (n = 7 and 6, respectively) and EpiT (1μM), after 5 minutes (n = 6). The results are given as mean ± SEM. For statistical analyses it was used Student T-test, ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni post-test and Friedman test followed by Dunn's post-test. This study was approved by the Ethics Committee for animal research of UFRGS (process number CEUA/UFRGS n° 22635). The iAR immunoreactivity was observed in Leydig and peritubular cells at all ages. No immunoreaction concerning of iAR was observed in Sertoli cells on pnd 4 and 5. At this age both, testosterone and epitestosterone increased 45Ca2+ uptake, within 5 minutes of incubation. Testosterone promoted membrane potential depolarization of Sertoli cells on pnd 5. FSH application followed by testosterone and epitestosterone reduced the depolarization of the two hormones. Application of epitestosterone five minutes after FSH resulted in a delay of epitestosterone-promoted depolarization. The cell resistance was also reduced in comparison with the resistance of the isolated application EpiT. Sertoli cells from rats on pnd 4 and 5 do not express iAR. Both T and EpiT act through non-classical mechanism stimulating calcium uptake in whole rat testes on dpn 4. T produces a depolarizing effect on the Sertoli cell membrane of rats on pnd 5 similar to observed at 15-day-old rats. This non classical action of androgens is mediated by a receptor, not yet identified, situated in the membrane cell or close to it, different from iAR. FSH, and testosterone/epitestosterone affect each other electrophysiological responses suggesting a cross talking in the intracellular signaling pathways.