Estudo imunoistoquímico de filamentos intermediários astrocitários de subnúcleos da amígdala medial sob ação de hormônios gonadais em ratos durante o desenvolvimento pós-natal e em ratas adultas

Abstract

A amígdala medial (MeA) é uma área sexualmente dimórfica que modula atividades neuroendócrinas e comportamentais e onde hormônios desempenham um importante papel na plasticidade neuro-glial e sináptica. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a vimentina (VIM) são eficientes marcadores do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar e estudar pela densitometria óptica a imunorreatividade dos filamentos intermediários e marcadores astrocitários GFAP e VIM (GFAP-ir; VIM-ir) nos três subnúcleos da amígdala medial, ântero-dorsal (MeAD), póstero-dorsal (MePD) e pósteroventral (MePV), de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: o primeiro utilizou ratas Wistar nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 20) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária dos subnúcleos da MeA. No segundo experimento, utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. No terceiro experimento foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n=72), cujas idades foram: 1 dia pós-natal (PN1), 5, (PN5), 11 (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). Todos os animais foram fixados por perfusão transcardíaca e seus encéfalos foram removidos, pós-fixados e processados para técnica de imunoistoquímica do anticorpo não marcado. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas,sendo aplicados testes post-hoc Tukey-Kramer. Além disso, ratas em proestro apresentaram maior GFAP-ir do que nas outras fases do ciclo estral (diestro, estro e metaestro; P<0,02). GFAP-ir é maior no MePD do que no MePV ou no MeAD (P<0,02). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol adicionado ou não à progesterona provocaram aumento da GFAP-ir no MePD e no MePV (P<0,001), mas não no MeAD (P>0,3). Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em fêmeas. Ratos em desenvolvimento apresentam dimorfismo sexual nos subnúcleos da MeA investigados. VIM é substituída por GFAP ao longo do desenvolvimento pós-natal. Houve diferença entre os sexos na VIM-ir em PN1, sendo que machos apresentaram maior VIM-ir no MeAD (P=0,001) e no MePV, (P<0,0001); em PN5, no MePD, com fêmeas apresentando maior VIM-ir (P<0,0001); e, em PN21, em todos os três subnúcleos estudados, machos apresentaram maior VIM-ir (MeAD, P = 0,009; MePD, P<0,001; e, MePV, P=0,012). A comparação dos dados de GFAP-ir também apresentou diferenças significativas. A interação entre sexo e idade demonstrou que há dimorfismo sexual em PN1 (machos com maior GFAP-ir; P < 0,001) e em PN45 (fêmeas com maior GFAP-ir; P=0,033). Quanto à interação de sexo e subregiões da MeA, houve diferença estatística no MePV, onde machos apresentaram maior GFAP-ir (P<0,001). Já quanto à interação das idades e subregiões da MeA, houve diferenças entre as áreas estudadas em PN1 (MePV>MeAD e MePD; P<0,001), em PN5 (MePV>MeAD; P<0,003), e em PN45 (MePD>MeAD e MePV; P<0,001). Esses achados permitem concluir que o dimorfismo sexual da MeA está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades subregionais nesta estrutura.Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas nas subregiões estudadas da MeA, ao longo dodesenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso.

The medial amygdala (MeA) is a sexually dimorphic area that modulates neuroendocrinol and behavioral activities and where gonadal hormones play an important role in neuron-gial and synaptic plasticity. Intermediate filaments, like the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM) are efficient markers of astrocytic cytoskeleton and are modified by gonadal hormones. The present study aimed to measure and study the optic densitometry of immunoreactivity in intermediate filaments and astrocytic markers GFAP and VIM (GFAP-ir; VIM-ir) in the three subnuclei; anterodorsal (MeAD), posterodorsal (MePD) and posteroventral (MePV) of the medial amygdala, of male and female rats during postnatal development. Moreover, the GFAP-ir in the same regions of adult females were also studied, in physiological conditions (across the estrous cycle), and by ovariectomy followed by ovarian hormone treatment. Three experiments were performed: the first used adult virgin females across the different phases of estrous cycle, diestrus, proestrus, estrus and metaestrus (n=20) in order to reveal any ovarian hormone induced alterations to astrocytic morphology in the MeA subnuclei. The second experiment used ovariectomized adult virgin (OVX) females (n=18) that received hormonal substitution with estradiol benzoate alone or plus progesterone. The third experiment used male and female Wistar rats (n=72) at different stages of postnatal development; postnatal day 1 (PN1), PN5, PN11, PN21, PN31 and PN45. All the animals were fixed by transcardiac perfusion and had their brains removed, post-fixed and processed following the unlabeled antibody procedure. The data were compared by two-way ANOVA for repeated measures and by the post-hoc Tukey-Kramer and t tests. The results show that the structural characteristics of GFAP-ir astrocytes in the MeA subnuclei are similar to those of other areas of the brain. Also, females in proestrus phase show higher GFAP-ir than the other phases of estrous cycle (diestrus, estrus and metaestrus) (P<0.02). GFAP-ir is higher in the MePD than in either the MePV or MeAD (P<0.02). In ovariectomized females,injections of estradiol alone or combined with progesterone led to an increase in GFAP-ir in both the MePD and MePV (P<0.001), but not in the MeAD (P>0.3), when compared to the control group data. These findings suggest that astrocytic GFAP may be affected by physiologic levels of ovarian hormones as well as by hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to the neural plasticity related to local and integrated activities of these areas in the female rat brain. Developing rats showed sexual dimorphism in the investigated subnuclei of the MeA. VIM is apparently substituted by GFAP during postnatal development. In relation to VIM-ir, differences were found between the sexes: at PN1, males showed higher VIM-ir in the MeAD (P=0.001) and in the MePV (P<0.0001); at PN5, females showed higher VIM-ir in the MePD, (P<0.0001); and, at PN21, in all studied subnuclei, males showed higher VIM-ir in the (MeAD, P=0.009; MePD, P<0.001 and MePV, P=0.012). Significant differences were also found in relation to the GFAP-ir data. The interaction between sex and age showed that there is sexual dimorphism at PN1 (males with higher GFAP-ir; P<0.001) and at PN45 (females with higher GFAP-ir; P=0.033). The interaction between sex and the MeA subregions showed a significant difference in the MePV, where males showed higher GFAP-ir (P<0.001). With regard the interaction between age and the MeA subregions there were differences at PN1 (MePV>MeAD and MePD; P<0.001), at PN5 (MePV>MeAD; (P<0.003), and at PN45 (MePD>MeAD and MePV; P<0.001 in both sexes). These findings suggest the presence of sexual dimorphism in the MeA at early developmental phases of rat nervous system, exhibiting regional particularities in the MeA. Moreover, the morphological differences found in the astrocytes from the studied MeA subnuclei across the development are probably related to the neuron-glia interaction, in accordance with behavioral aspects and neuroendocrine adjustments pertinent to each sex, and each phase of differentiation of the nervous system.