Seleção, isolamento e otimização dos meios de cultivo de microorganismos produtores de enzimas para aplicação ao processamento de peles na etapa de depilação/caleiro

Abstract

A indústria coureira tem se deparado com novos desafios e a necessidade de melhorar e otimizar processos, a fim de atingir a qualidade exigida em seus artigos finais bem como atender a legislação ambiental. A utilização de enzimas na produção de couros é uma alternativa para a redução do impacto ambiental desta atividade. As enzimas comerciais existentes, ainda não possuem especificidade suficiente, tampouco suas características são conhecidas em detalhes. Além disso, sua atividade é determinada utilizando caseína como substrato, sendo que as peles bovinas não possuem esta proteína. Desta forma, é importante que características tais como atividade sobre colágeno e queratina sejam conhecidas, bem como que sejam buscadas novas enzimas para aplicação na indústria do couro e avaliada detalhadamente sua ação nos processos de ribeira. Neste trabalho, foram caracterizadas cinco enzimas comerciais, normalmente, aplicadas às etapas de remolho, caleiro e purga. Para tanto, foram testadas diferentes temperaturas, valores de pH, a estabilidade térmica das mesmas, bem como a ação de inibidores e produtos químicos comumente utilizados em conjunto com as enzimas. A temperatura ótima de ação das enzimas ficou em torno de 55°C, em valores de pH que variaram de 9 a 12, as enzimas se mostraram estáveis a 37°C e perderam totalmente sua atividade quando expostas durante 120 min. a 55°C. Com base nestes dados, foram isoladas e selecionadas, a partir de lodo da estação de tratamento de efluentes de um curtume, 10 bactérias produtoras de enzimas com possibilidade de aplicação na produção mais limpa de couros, isto é, como substituintes de produtos químicos no processo. Dentre estas 10, duas bactérias com morfologias distintas foram escolhidas para estudos mais detalhados, porém, as duas colônias foram identificadas como Bacillus subtilis e serão chamadas neste trabalho de BLBc 11 e BLBc 17. O meio de cultivo, o pH e a temperatura foram otimizados através do planejamento experimental. Para a seleção das variáveis significativas para a produção de proteases, uma variedade de fontes de carbono (glicose, maltose, glicerol), fontes de nitrogênio (extrato de levedura, peptona, farelo de soja), sais inorgânicos (sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, sulfato de ferro heptahidratado) foram testados e identificados através do planejamento experimental Plackett-Burmann. Para a bactéria BLBc 11, os fatores que apresentaram efeito significativo para o meio de cultivo foram extrato de levedura, peptona e farelo de soja, os quais foram otimizados através de um planejamento composto central rotacional (CCR). O pH e a temperatura foram otimizados através da utilização de um planejamento fatorial, ambos apresentaram efeito significativo sobre a produção de proteases. Para a bactéria BLBc 17 o pH e a temperatura foram otimizados através de um planejamento CCR. Após estas etapas, as enzimas produzidas pelas bactérias BLBc 11 e 17 foram caracterizadas e aplicadas na etapa de depilação de peles bovinas. A ação enzimática foi avaliada com base na quantificação de proteínas interfibrilares e hidroxiprolina liberados para o banho residual, além da avaliação das amostras obtidas em microscópio óptico e de varredura. Análises comparativas (DQO, BDO e nitrogênio total) entre o processo convencional e o processo usando enzimas foram realizadas e demonstraram que o processo proposto neste trabalho tem grandes perspectivas de sucesso.

Leather industry has been facing with new challenges and the need to improve and optimize processes in order to achieve required quality in their final articles as well as meet the environmental legislation. The enzymatic treatment of leather is a promising technology. However, the reaction kinetics of commercial enzymes available to the leather industry are not fully understood and their activities have been mainly determined over model proteins such as casein as substrate, which is absent in cattle hides. Therefore, it is important to determine their activities on collagen and keratin, the main proteins of skin; and also the screening and isolation of new enzymes in order to use these enzymes in leather processing. In this work, were tested five commercial proteases, normally applied during soaking, liming and bating operations. Thus, were tested different temperatures, pH values, the thermal stability of the enzymes and the action of inhibitors and chemicals commonly used together with them. Kinetics of temperature and pH of enzymes were very similar for all five enzymes, with maximal activities around 55°C and 9 to 12, respectively. The enzymes were stable at 37 °C and lost completely its activity when exposed for 120 min. at 55 °C. Based on these data, were isolated and selected from a tannery treatment effluent, 10 bacteria producing enzymes with potential application in cleaner leather production. Among these 10, two bacteria with different morphologies were chosen for detailed study; however, the two colonies were identified as Bacillus subtilis and will be called in this work BLBc 11 and BLBc 17. The culture medium, pH and temperature of cultivation were optimized through experimental design. For the selection of significant variables for protease production, a variety of carbon sources (glucose, maltose, glycerol), nitrogen sources (yeast extract, peptone, soybean meal), inorganic salts (magnesium sulfate, calcium chloride, heptahydrate ferrous sulfate) were tested and identified via Plackett-Burmann design experiments. For bacterium BLBc 11, the factors that presented significant effect for protease culture medium were yeast extract, peptone and soybean meal, these were optimized using a central composite design (CCD). The pH and the temperature were optimized using factorial design, both presented significant effect. For bacterium BLBc 17 pH and temperature were optimized using a CCD. After these steps, the enzymes produced by bacteria BLBc 11 and 17 were characterized and applied in cattle hide unhairing. This step was evaluated measuring inter-fibrillary proteins and hydroxyproline released into the bath, and also using optical and scanning electronic microscopy. Comparative analysis (COD, BOD and total nitrogen) between conventional and enzymatic process were made and show that the proposed process have excellent prospects of success.