Isolamento e identificação de bactérias bioluminescentes de animais e de ambientes naturais marinhos de Imbé e Tramandaí, Litoral Norte do Rio Grande do Sul, Brasil

Abstract

Durante o período de julho de 2010 a abril de 2011 foram coletadas 33 amostras de água e 23 amostras de animais marinhos das adjacências da zona de estuário da Bacia Hidrográfica do Rio Tramandaí, no Litoral Norte do Rio Grande do Sul, Brasil, com o objetivo de isolar e identificar bactérias bioluminescentes, relacionar a carga microbiana total e bioluminescente das amostras de água com suas características físico-químicas e selecionar os isolados com potencial para atuar como fontes doadoras de genes de bioluminescência. Obtiveram-se amostras de água superficial do estuário, em um ponto de Imbé, e do mar, em três pontos de Tramandaí: zona de pós-arrebentação, zona intermediária entre o estuário e as monobóias, e zona das monobóias do Terminal Marítimo Almirante Soares Dutra (TEDUT). Potencial hidrogeniônico, oxigênio dissolvido, temperatura e salinidade foram parâmetros aferidos nas amostras de água. Alíquotas de 0,1 e 1 mL foram inoculadas nos meios Ágar Marinho e TCBS. Após 24h de incubação, a carga microbiana das amostras foi determinada em Unidades Formadoras de Colônia por mL de água. Bactérias bioluminescentes foram constatadas nos quatro pontos amostrados. Das 33 amostras de água, 27 apresentaram bactérias bioluminescentes (81%). Os parâmetros que mais aparentaram influenciar a carga microbiana bioluminescente das amostras foram temperatura e salinidade. Bactérias bioluminescentes não foram observadas em amostras com temperatura inferior a 18°C. A maior carga microbiana bioluminescente (690 UFC/mL) foi observada em fevereiro na amostra da zona de pós-arrebentação, sob a temperatura de 23°C e a salinidade de 38,44 ‰, o maior valor constatado para este parâmetro. Apesar de terem sido feitas três amostragens com invertebrados marinhos, foram observadas colônias bioluminescentes somente nas amostras do mês de fevereiro, no qual também foram constatadas as maiores cargas microbianas bioluminescentes nas amostras de água. A coleta do muco superficial da anêmona, da craca e do briozoário, com o auxílio de suábes, permitiu a observação de bactérias bioluminescentes agregadas na superfície destes animais na forma de biofilme. Os 14 peixes analisados também representaram fontes de bactérias bioluminescentes nas águas costeiras de Imbé e Tramandaí, mesmo quando estas bactérias não foram abundantes na coluna d’água. Após diferentes ciclos de purificação, um total de 44 isolados bioluminescentes foi obtido. Até o presente momento, apenas 15 isolados obtidos a partir das amostras de água ainda expressam bioluminescência. Os isolados caracterizados como BL 15, BL 16, BL 20a e BL 21 representaram ideais fontes doadoras de genes da bioluminescência, pois demonstraram a capacidade de expressar luminescência após 144h de incubação. Amostras de DNA de dez isolados foram submetidas ao sequenciamento do gene 16S rDNA, mas o produto obtido apresentou má qualidade e não permitiu a análise confiável dos nucleotídeos de forma a identificar os isolados em nível de espécie. O perfil genotípico de 14 isolados foi agrupado pela técnica de DNA fingerprinting Microsatellite-Primed (MSP-PCR) e revelou que estes provavelmente pertençam à mesma espécie. Amostras de DNA dos isolados BL 11a, BL 12, BL 16 e BL 34, escolhidos como representantes do grupo, serão novamente sequenciadas.

From July 2010 until April 2011, 33 samples of water and 23 samples of marine animals were collected in adjacencies of River Tramandaí Watershed estuarine zone with the objetive of isolating and identifying bioluminescent bacteria, correlating the presence of these bacteria with physical-chemical characteristics of the water samples and selecting isolates with potential for acting as donor sources of bioluminescent genes. Samples were collected from surface water of the estuary at a point in Imbé, and the sea on three points in Tramandaí: post-surf zone, intermediate zone between the estuary and the single point mooring and the Maritime Terminal Almirante Soares Dutra Area single point mooring zone. Hydrogenionic potential, dissolved oxygen, temperature and salinity parameters were measured in water samples. Aliquots of 0.1 and 1 mL were inoculated in Marine Agar and TCBS. After 24 hours of incubation, the microbial load of the samples was determined in colony forming units per mL of water. Bioluminescent bacteria were detected in four sampling sites. Of the 33 samples of water, 27 showed bioluminescent bacteria (81%). The parameters that seemed to influence the bioluminescent microbial load of the samples were temperature and salinity. Bioluminescent bacteria were not observed in samples with temperature below 18°C. The major bioluminescent microbial load (690 CFU/mL) was observed in February in the sample of post-surf zone, the temperature under 23°C and salinity of 38.44 ‰, the highest value found for this parameter. Although there were made three samplings with marine invertebrates, bioluminescent colonies were observed only in samples of February, in which the largest bioluminescent microbial loads in water samples were found. The sampling of surficial mucus of the anemone, of the barnacle and of the bryozoan, with the aid of swabs, allowed the observation of bioluminescent bacteria aggregated on the surface of these animals in the form of biofilm. The 14 fishes analyzed also were sources of bioluminescent bacteria in coastal waters of Imbé/Tramandaí, even when these bacteria were not abundant in the water column. After several cycles of purification, were obtained a total of 44 isolated bioluminescent. To date, only 15 isolates obtained from the samples of water still express bioluminescence. Isolates characterized as BL 15, BL 16, BL 21 and BL 20a represent ideal donor sources of bioluminescence genes, as they demonstrated the ability to express luminescence after 144h of incubation. DNA samples from ten isolates were subjected to sequencing of the 16S rDNA, but the product showed poor quality and did not allow reliable analysis of nucleotides in order to identify the isolates at species level. The genotypic profile of 14 isolates was grouped by the technique of DNA fingerprinting Microsatellite-primed (MSP-PCR) and showed that they probably belong to the same species. DNA samples isolates from the BL 11a, BL 12, BL 16 and BL 34 were chosen as representatives of the group, and will be sequenced again.