Processamento de urease de Canavalia ensiformis por ninfas e adultos de Dysdercus peruvianus (Hemiptera : Pyrrhocoridae)

Abstract

Ureases são enzimas que hidrolisam uréia em amônia e dióxido de carbono, encontradas em plantas, fungos e bactérias. A urease das sementes de Canavalia ensiformis (jackbean urease - JBU) foi a primeira proteína a ser cristalizada. A Canatoxina (CNTX), uma isoforma dessa urease, é tóxica para insetos e fungos, sugerindo um papel na defesa dessas plantas. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptideo com 10 kDa a partir de ureases por enzimas tipo catepsina no intestino do inseto, sendo independente da propriedade ureolítica. O modelo usado nesse estudo é o hemíptero Dysdercus peruvianus, praga da cultura do algodão. Ninfas desse inseto são suscetíveis aos efeitos de ureases, mas os adultos não o são. Nesse trabalho estudamos o processamento da JBU por enzimas digestivas de adultos e ninfas. Ensaios de atividade enzimática de homogeneizados de intestino de adultos e ninfas de 4° estádio sobre diferentes substratos, sintéticos e protéicos foram realizados, visando caracterizar pH ótimo de atividade, perfil de inibição e as proteases majoritárias presentes. O padrão de fragmentação JBU foi determinado através de hidrólise in vitro. JBU foi incubada por 24 horas com cada homogeneizado e os fragmentos formados foram analisados por SDS-PAGE seguido de Western Blot. Nas condições testadas (37°, pH 5,6), observamos a hidrólise de JBU pelas enzimas das ninfas e adultos, mas apenas o homogeneizado de ninfas formou fragmentos em torno de 10 kDa. Os resultados de atividade enzimática com substratos protéicos mostram a presença de serino proteases (inibidas por PMSF), somente no homogeneizado de adultos. Ninfas e adultos possuem aspártico e cisteíno proteases, porém, aparentemente, ninfas possuem um conteúdo maior de aspártico proteases. O peptídeo entomotóxico é clivado por aspártico proteases nas ninfas e por cisteíno proteases nos adultos. Usando substratos peptídicos sintéticos que equivalem às regiões que flanqueiam o peptídeo entomotóxico na urease intacta, observamos um perfil diferencial de clivagem para adultos e ninfas. Os dados indicam um processamento distinto de JBU pelas diferentes enzimas presentes nos dois estágios do inseto, sendo que essas diferenças respondem pelo menos em parte pela susceptibilidade estágio-dependente dos insetos às ureases.