Identificação rápida de micobactérias pela análise do fragmento do gene hsp65 através da PCR e enzimas de restrição

Abstract

Grande parte das infecções humanas são causadas por micobactérias de crescimento lento como M. tuberculosis, M. avium complex (MAC) e M. kansasii. Além disso, têm-se registrado um aumento significativo de doenças causadas por micobactérias atípicas (micobacterioses), principalmente devido à AIDS. Visando a importância clínica com relação aos esquemas de tratamento e as implicações epidemiológicas, a diferenciação rápida das mesmas torna-se fundamental. Para tanto o objetivo do trabalho foi a padronização de um método molecular mais rápido que a técnica convencional de identificação bioquímica, para posterior utilização na Seção de Biologia Molecular do IPB-LACEN/RS. A metodologia proposta baseou-se na amplificação do gene hsp65 por PCR e digestão com enzimas de restrição Haelli e BstEIl (PRA). A análise foi realizada através do perfil eletroforético dos fragmentos digeridos e visualizados em gel de agarose 4%. O software GelCompar foi utilizado durante as análises e os resultados foram comparados com um banco de dados disponível na Internet (PRASITE). Para o estudo foram selecionadas 70 culturas de diferentes micobactérias, isoladas a partir de amostras clínicas de pacientes da Rede de Saúde Pública do Estado. Das 70 amostras analisadas, 53 foram identificados sendo M. tuberculosis, quatorze amostras foram consideradas micobactérias atípicas e 3 não apresentaram resultados bioquímicos conclusivos, sendo então denominadas como MOTTs, pelos métodos convencionais. Utilizando o PRA, 60 amostras apresentaram resultados concordantes com a metodologia convencional. Aquelas que apresentaram resultados discordantes foram submetidas a amplificação com primers específicos para M. avium, M. tuberculosis e/ou sequenciamento de DNA. Os resultados obtidos pelo PRA e confirmados pelos testes adicionais demonstraram uma sensibilidade de 95,2%, quando comparado com os testes bioquímicos. Portanto, a metodologia padronizada demonstrou possuir um bom poder discriminatório entre as espécies, diminuindo o tempo de identificação para 2 dias.