Análise de morte celular e da via de sinalização do IGF-1R em células da linhagem de adenocarcinoma endometrial Ishikawa como efeito do tratamento com metformina e resveratrol

Abstract

O câncer endometrial (CE) é uma neoplasia maligna no revestimento epitelial uterino com incidência crescente em países desenvolvidos. Doenças como a obesidade e a Diabetes Mellitus estão atreladas ao CE, pois elevam a circulação de agentes mitogênicos e antiapoptóticos como a insulina, fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e estrogênio. A Metformina é um fármaco insulino-sensibilizante usado para o tratamento da hiperglicemia/diabetes com mecanismo de ação atrelado à inibição do complexo I da cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria. Segundo estudos epidemiológicos e revisões da literatura, a Metformina pode reduzir a incidência do CE como medida preventiva. Ainda, possui função terapêutica ao diminuir o crescimento do câncer, interferindo na via de sinalização de proliferação PI3K/Akt-mTOR. O Resveratrol é um polifenol natural de ação pleiotrópica encontrado em diversos alimentos, podendo também envolver-se na via supracitada e nas funções mitocondriais. Este trabalho objetivou avaliar os efeitos do tratamento com Metformina e Resveratrol, separadamente ou combinado, nas células da linhagem de adenocarcinoma endometrial Ishikawa. Para isso, os experimentos foram conduzidos com tratamentos de 48 horas, abrangendo tanto as doses individuais ou combinadas mais baixas (0,1 mM para a Metformina e 0,1 μM para o Resveratrol) quanto as mais altas (25 mM para a Metformina e 75 μM para o Resveratrol). Foram realizados ensaios de viabilidade celular (MTT e Sulforrodamina B), de função mitocondrial e morte celular (Mitotracker e Anexina/PI), de citotoxicidade e ativação de caspases (ApoTox™) e de expressão gênica (RT-qPCR) de genes importantes da via supracitada (AKT-2, IGF-1, INSR, IGF-1R, IRS1, entre outros). Também foi realizado um estudo in silico através do software CYTOSCAPE através do banco de dados STRING e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto, para compreender a relação destes genes com outros importantes no desenvolvimento do CE. O efeito sobre a viabilidade celular foi dose- e tempo-dependente para a Metformina, e dose-dependente para o Resveratrol. O tratamento com Metformina causou dano mitocondrial, indicado pela diminuição da atividade e o aumento da massa da organela, resultando em intensa apoptose através da ativação de caspases. O tratamento com Resveratrol causou a diminuição da massa/quantidade e função mitocondrial, da citotoxicidade e da ativação de caspases. Por outro lado, o tratamento conjunto diminuiu a atividade metabólica/mitocondrial, reduzindo a citotoxicidade e a ativação das caspases. Em nível celular, o Resveratrol possivelmente interfere de forma protetiva nos efeitos tóxicos da Metformina. Na abordagem em nível molecular, optou-se estudar os efeitos das concentrações mais baixas de Metformina e Resveratrol, consideradas biodisponíveis. No entanto, os resultados obtidos pelo método empregado não apresentaram significância estatística. O estudo in silico apontou moléculas importantes da via PI3K/Akt-mTOR e outras relacionadas, que podem contribuir para desencadear os efeitos celulares observados em resposta aos tratamentos realizados. Portanto, embora seja possível inferir que a MF e o RSV possam atuar nos principais efetores da via PI3K/Akt/mTOR, interferindo nas ações um do outro, estudos moleculares adicionais e períodos mais longos de tratamento são necessários para confirmar ou refutar esta hipótese.

increasing incidence in developed countries. Diseases such as obesity and Diabetes Mellitus are linked to EC, as they increase the circulation of mitogenic and antiapoptotic agents such as insulin, type 1 insulin-like growth factor and estrogen. Metformin is an insulin-sensitizing drug used to treat hyperglycemia/diabetes with a mechanism of action linked to the inhibition of complex I of the electron transport chain in the mitochondria. According to epidemiological studies and literature reviews, Metformin can reduce the incidence of EC as a preventive measure. Furthermore, it has a therapeutic function by reducing cancer growth, interfering with the PI3K/Akt-mTOR proliferation signaling pathway. Resveratrol is a natural polyphenol with pleiotropic action found in various foods and may also be involved in the aforementioned pathway and mitochondrial functions. This work aimed to evaluate the effects of treatment with Metformin and Resveratrol, separately and together, in the Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell line. For this, the experiments were conducted with 48-hour treatments, covering both the lowest individual or combined doses (0.1 mM for Metformin and 0.1 μM for Resveratrol) and the highest (25 mM for Metformin and 75 μM for Resveratrol). Cell viability assays were performed (MTT and Sulforhodamine B), mitochondrial function and cell death (Mitotracker and Annexin/PI), cytotoxicity and caspase activation (ApoTox™), and gene expression (RT-qPCR) of important genes of the pathway mentioned above were conducted (AKT-2, IGF-1, INSR, IGF-1R, IRS1, among others). An in silico study was also carried out using the CYTOSCAPE software through the STRING database and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, to understand the relationship of these genes with others important for the development of EC. The effect on cell viability was dose- and time-dependent for Metformin, and dose-dependent for Resveratrol. Metformin treatment caused mitochondrial damage indicated by the decreased activity and increased organelle mass, providing intense apoptosis through the activation of caspases. Treatment with Resveratrol caused a decrease in the mitochondrial mass/quantity and function, cytotoxicity and caspase activation. Co-treatment decreased metabolic/mitochondrial activity, reducing cytotoxicity and caspase activation. At a cellular level, Resveratrol possibly interferes protectively in the toxic effects of Metformin. In the molecular level approach, it was chosen to study the effects of the lowest concentrations of MF and RSV, considered bioavailable. However, the results obtained by the method used did not show statistical significance. The in silico study identified important molecules in the aforementioned pathway, in addition to others that are related, which may contribute to triggering the cellular effects observed in response to the treatments performed. Thus, although it is possible to infer that MF and RSV can act on the main effectors of the PI3K/Akt/mTOR pathway, interfering with each other's actions, to confirm or refute this hypothesis, further studies using higher doses and longer periods will be necessary for treatment.