Nanoemulsões contendo extratos de Pterocaulon balansae Chodat. (Asteraceae) : estudos de toxicidade, formulação e de atividades antifúngica e cicatrizante

Abstract

O gênero Pterocaulon (Asteraceae) inclui várias espécies tradicionalmente utilizadas na medicina popular, especialmente no tratamento de doenças de pele. As propriedades atribuídas a essas plantas estão frequentemente relacionadas à presença de cumarinas. Esta tese tem como objetivo desenvolver formulações tópicas contendo extratos otimizados de Pterocaulon balansae, com ênfase nas atividades antidermatofíticas e cicatrizantes. Na primeira etapa, avaliamos a toxicidade de três extratos verdes de P. balansae padronizados em cumarinas totais (aquoso, hidroetanólico e fluido supercrítico de CO2 ) em fibroblastos (MRC5) e queratinócitos (HaCaT), utilizando ensaios MTT e SRB, citometria de fluxo, irritação em membranas de ovos de galinha embrionados (HET-CAM) e o teste de Ames para mutagenicidade. Os extratos apresentaram um perfil semelhante nos ensaios MTT e SRB, mostrando elevada viabilidade celular (até 12,5 μg/mL de cumarinas totais), com morte celular por necrose em ambas as linhagens. No ensaio HET-CAM e na avaliação de mutagenicidade, o extrato obtido por fluido supercrítico de CO2 mostrou-se mais tóxico nas concentrações mais elevadas de cumarinas. No segundo capítulo, os três extratos foram incorporados em nanoemulsões tópicas, obtidas por emulsificação espontânea. As formulações apresentaram-se monodispersas (índice de polidispersão <0,2), com diâmetro médio de gotícula entre 250 e 280 nm e potencial zeta negativo (-60 mV). Tanto os extratos quanto as formulações foram testados contra um painel de fungos dermatófitos, apresentando os menores valores de concentração inibitória mínima para o extrato aquoso. A toxicidade das formulações em queratinócitos (HaCaT), o perfil de irritação em HETCAM e as interações com as camadas da pele foram avaliados por histologia (microscopia óptica e confocal). Os resultados mostraram que as formulações não causaram irritação, mantendo a viabilidade de HaCaT acima de 80% após 24 horas de incubação, sem efeitos deletérios observados nas imagens de microscopia. No último capítulo, nanoemulsões contendo o extrato hidroalcoólico foram espessadas com ácido hialurônico, o que reduziu a cinética de liberação das cumarinas e aumentou a força bioadesiva das formulações. As cumarinas se distribuíram nas camadas da pele intacta em maior quantidade do que a partir do extrato, com um aumento significativo desses compostos observado em pele lesada, atingindo o fluido receptor. O estudo de cicatrização de feridas em ratos Wistar mostrou que o hidrogel contendo 1 mg/mL de cumarinas totais resultou em um fechamento mais rápido das feridas, em comparação com os outros grupos. Esses achados estão em acordo com os resultados histológicos e dos marcadores inflamatórios. Em conclusão, os resultados indicam o potencial das formulações contendo extratos de P. balansae para a cicatrização de feridas e o tratamento de infecções fúngicas causadas por dermatófitos.

The genus Pterocaulon (Asteraceae) includes several species traditionally used in folk medicine, particularly for treating skin diseases. The properties attributed to these plants are often related to the presence of coumarins. This thesis aims to develop topical formulations with optimized extracts of Pterocaulon balansae, focusing on antidermatophytic and wound-healing activities. In the first stage, we evaluated the toxicity of three green extracts of P. balansae standardized for total coumarins (aqueous, hydroalcoholic, and supercritical CO2) on fibroblasts (MRC5) and keratinocytes (HaCaT) using MTT and SRB assays, flow cytometry, irritation tests on chicken embryonic membranes (HET-CAM), and the Ames test for mutagenicity. The extracts showed a similar profile in the MTT and SRB assays, demonstrating high cell viability (up to 12.5 μg/mL of total coumarins), with cell death occurring via necrosis in both cell lines. In the HET-CAM assay and mutagenicity evaluation, the supercritical CO2 extract was more toxic at higher concentrations of coumarins. In the second chapter, the three extracts were incorporated into topical nanoemulsions obtained through spontaneous emulsification. The formulations were monodispersed (polydispersity index <0.2), with an average droplet diameter between 250 and 280 nm and a negative zeta potential (-60 mV). Both the extracts and the formulations were tested against a panel of dermatophyte fungi, showing the lowest minimum inhibitory concentration values for the aqueous extract. The toxicity of the formulations in keratinocytes (HaCaT), the irritation profile in HET-CAM, and interactions with skin layers were assessed through histology (optical and confocal microscopy). The results indicated that the formulations did not cause irritation, maintaining HaCaT viability above 80% after 24 hours of incubation, with no deleterious effects observed in microscopy images. In the final chapter, nanoemulsions containing the hydroalcoholic extract were thickened with hyaluronic acid, which reduced the release kinetics of the coumarins and increased the bioadhesive strength of the formulations. The coumarins were distributed in the intact skin layers in greater amounts than from the extracts, with a significant increase in these compounds observed in damaged skin, reaching the receptor fluid. The wound healing study in Wistar rats demonstrated that the hydrogel containing 1 mg/mL of total coumarins resulted in faster wound closure compared to the other groups. These findings are in line with histological results and inflammatory markers. In conclusion, the results indicate the potential of formulations containing extracts of P. balansae for wound healing and the treatment of fungal infections caused by dermatophytes.