Construção e expressão de um operon sintético para produção de poli-3-hidroxibutirato em sistema cell-free de Vibrio natriegens

Abstract

O acúmulo crescente de plásticos sintéticos no ambiente tem causado graves impactos ecológicos, destacando a necessidade de alternativas sustentáveis. Nesse cenário, o poli-3-hidroxibutirato (PHB) emerge como um polímero biodegradável com propriedades semelhantes às dos plásticos convencionais. Contudo, o elevado custo de produção tem restringido sua aplicação em larga escala, reforçando a busca por soluções tecnológicas que viabilizem sua fabricação de forma mais acessível. Os sistemas de síntese de proteínas livre de células têm se mostrado uma abordagem promissora, permitindo a produção de compostos biotecnológicos sob condições controladas, com maior flexibilidade e sem as limitações associadas ao uso de células vivas. Entre os organismos candidatos para esse sistema, Vibrio natriegens destaca-se devido à sua rápida taxa de crescimento e robusto maquinário biossintético, oferecendo vantagens significativas em termos de eficiência e rendimento. Com base no que foi exposto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma abordagem baseada em sistema livre de células de V. natriegens para a produção de PHB, abordando a lacuna de alternativas economicamente viáveis e eficientes para este biopolímero. Para isso, foi projetado, in silico, um operon sintético contendo os genes da via biossintética do PHB, que posteriormente foi construído in vitro por meio de técnicas de biologia sintética. Extratos celulares de V. natriegens foram preparados e empregados em reações livres de células para expressão do operon e produção de PHB. A detecção e quantificação do polímero foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados confirmaram a funcionalidade do operon sintético em sistemas livres de células de V. natriegens, com produção de PHB detectada por HPLC. Conclui-se que a utilização de sistemas de síntese de proteínas livre de células baseados em V. natriegens representa uma estratégia tecnicamente viável para a redução de custos na produção de PHB. Estudos futuros devem ser direcionados para a otimização dos parâmetros experimentais, incluindo melhorias no processo de análise por HPLC e a prototipagem sob diferentes condições reacionais, a fim de expandir a eficiência e viabilidade dessa metodologia.

The growing accumulation of synthetic plastics in the environment has caused severe ecological impacts, highlighting the need for sustainable alternatives. In this context, poly-3-hydroxybutyrate (PHB) emerges as a biodegradable polymer with properties similar to those of conventional plastics. However, its high production cost has limited its large-scale application, emphasizing the need for technological solutions to enable its more affordable manufacturing. Cell-free protein synthesis systems have shown promise as a novel approach, allowing the production of biotechnological compounds under controlled conditions, with greater flexibility and without the limitations associated with living cells. Among the candidate organisms for this system, Vibrio natriegens stands out due to its rapid growth rate and robust biosynthetic machinery, offering significant advantages in terms of efficiency and yield. Leveraging these characteristics, this study aimed to develop a cell-free system based on V. natriegens for PHB production, addressing the gap in economically viable and efficient alternatives for this biopolymer. For this purpose, a synthetic operon containing the genes of the PHB biosynthetic pathway was designed in silico and subsequently constructed in vitro using synthetic biology techniques. Cell extracts from V. natriegens were prepared and used in cell-free reactions to express the operon and produce PHB. Detection and quantification of the polymer were performed by high-performance liquid chromatography (HPLC). The results confirmed the functionality of the synthetic operon in V. natriegens cell-free systems, with PHB production detected via HPLC. It is concluded that using a V. natriegens based cell-free protein synthesis systems represents a technically viable strategy for reducing PHB production costs. Future studies should focus on optimizing experimental parameters, including improvements in HPLC analysis processes and prototyping under different reaction conditions, to enhance the efficiency and feasibility of this methodology.