Resposta diferencial à cisplatina em modelo dinâmico de cultivo de esferoides tumorais de adenocarcinoma pulmonar humano

Abstract

Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), o câncer de pulmão foi a segunda principal causa de mortes entre homens e mulheres em 2023, com o tabagismo sendo o principal fator de risco. O National Cancer Institute (NCI) classifica o câncer de pulmão em duas categorias principais: câncer de pequenas células e câncer de não pequenas células, com o adenocarcinoma pulmonar enquadrado na segunda. O câncer de pulmão localizado apresenta uma taxa de sobrevida média de 62,8% em 5 anos, enquanto os casos metastáticos, que representam 53% dos diagnósticos, têm apenas 8,2% de sobrevida estimada. A incidência do adenocarcinoma pulmonar aumenta significativamente em pessoas acima de 50 anos, sendo classificado em lesões Pré-invasivas e invasivas. Para estudar os mecanismos patológicos desse tipo de câncer, modelos celulares pré-clínicos são amplamente utilizados. O cultivo em monocamada (2D) é o modelo mais comum nos laboratórios, mas não consegue reproduzir com precisão as características fisiopatológicas dos tumores sólidos. Como alternativa, o cultivo multicelular tridimensional (esferoides) tem ganhado destaque, pois simula melhor o ambiente tumoral, replicando a complexidade dos tecidos tumorais humanos. Nesse modelo, as células experimentam variações nas concentrações de oxigênio, nutrientes e fármacos, resultando em uma em uma semelhança com o ambiente tumoral in vivo, o que o torna eficaz para testar novos tratamentos terapêuticos para o câncer de pulmão. Nosso grupo de pesquisa tem se concentrado na padronização das condições de cultivo de células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 em esferoides e na caracterização dessas estruturas ao longo de diferentes dias de cultivo (DIV). Estabelecemos as condições ideais para a formação de esferoides únicos em poços revestidos com agarose e acompanhamos seu crescimento e maturação por até 20 DIV. Observamos que os esferoides multicelulares apresentam uma evolução ao longo dos dias in vitro. Essas observações foram confirmadas por marcação com anticorpo anti-Ki67, que detecta células proliferativas, e pela coloração com Hematoxilina e Eosina (HE), revelando a presença de centros necróticos e hipóxicos. Além disso, a cofilina-1, uma proteína que modula as dinâmicas de actina, e está envolvida na plasticidade celular, ademais muitos estudos já demonstram seus efeitos em células cancerígena, estando relacionada a rádio/quimiorresistência e metástase. Dado que a cisplatina é o quimioterápico padrão-ouro para o tratamento do câncer de pulmão, nosso projeto busca avaliar como as variações no crescimento e na estrutura dos esferoides influenciam a resposta ao tratamento com cisplatina. Os objetivos deste projeto incluem estabelecer diferentes protocolos de tratamento com cisplatina em esferoides em distintos estágios de crescimento e analisar a resposta citotóxica. Esperamos que este estudo ajude a caracterizar a heterogeneidade dos esferoides ao longo dos diferentes DIVs e a desenvolver terapias mais eficazes e personalizadas para o tratamento do câncer de pulmão.

According to the National Cancer Institute (INCA), lung cancer was the second leading cause of death among men and women in 2023, with smoking being the main risk factor. The National Cancer Institute (NCI) classifies lung cancer into two main categories: small cell cancer and non-small cell cancer, with lung adenocarcinoma falling under the latter. Localized lung cancer has a mean survival rate of 62.8% at 5 years, while metastatic cases, which account for 53% of diagnoses, have only an estimated 8.2% survival. The incidence of lung adenocarcinoma increases significantly in people over 50 years of age, being classified into pre-invasive and invasive lesions. Preclinical cell models are widely used to study the pathological mechanisms of this type of cancer. Monolayer (2D) culture is the most common model in laboratories, but it cannot accurately reproduce the pathophysiological characteristics of solid tumors. As an alternative, three-dimensional multicellular culture (spheroids) has gained prominence, as it better simulates the tumor environment, replicating the complexity of human tumor tissues. In this model, cells experience variations in oxygen, nutrient, and drug concentrations, resulting in a similarity to the tumor environment in vivo, which makes it effective for testing new therapeutic treatments for lung cancer. Our research group has focused on standardizing the culture conditions of human adenocarcinoma A549 cells in spheroids and characterizing these structures over different culture days (IVD). We establish the optimal conditions for the formation of single spheroids in agarose-lined wells and track their growth and maturation for up to 20 DIV. We observed that multicellular spheroids present an evolution over the days in vitro. These observations were confirmed by anti-Ki67 antibody staining, which detects proliferative cells, and by staining with hematoxylin and eosin (HE), revealing the presence of necrotic and hypoxic centers. In addition, cofilin-1, a protein that modulates actin dynamics, and is involved in cell plasticity, in addition to many studies already demonstrating its effects on cancer cells, being related to radio/chemoresistance and metastasis. Given that cisplatin is the gold standard chemotherapy for the treatment of lung cancer, our project seeks to evaluate how variations in spheroid growth and structure influence the response to cisplatin treatment. The objectives of this project include establishing different treatment protocols with cisplatin in spheroids at different stages of growth and analyzing the cytotoxic response. We hope that this study will help to characterize the heterogeneity of spheroids across different IVDs and to develop more effective and personalized therapies for the treatment of lung cancer.