Investigação da harmina no crescimento e diferenciação de neurônios do modelo murino do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH)

Abstract

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é caracterizado pelos sintomas de desatenção, hiperatividade e impulsividade. A sintomatologia do transtorno é influenciada pelo gênero dos pacientes, uma vez que os meninos apresentam mais impulsividade e hiperatividade, enquanto as meninas, desatenção. Quanto a sua etiologia, ainda é pouco conhecida, mas estudos de neuroimagem revelam um desenvolvimento cortical tardio nos pacientes com TDAH, além de hipofunção dopaminérgica e disfunções serotoninérgicas. A harmina é uma β-carbolina componente da ayahuasca, em conjunto com a dimetiltriptamina (DMT). O principal mecanismo de ação da harmina é a inibição da monoamina oxidase A (MAO-A), enzima que catalisa a desaminação oxidativa de monoaminas como a serotonina, dopamina, noradrenalina e adrenalina. Desse modo, ao inibir a MAO-A e aumentar a concentração de monoaminas na fenda sináptica, a harmina pode atenuar sintomas do TDAH. Neste trabalho, a administração da harmina foi avaliada no crescimento dos neurônios in vitro e no fenótipo comportamental do modelo animal do TDAH in vivo. Foram cultivados os neurônios do córtex frontal dos ratos espontaneamente hipertensos (SHR) - modelo experimental do TDAH - e sua linhagem controle (WKY) com veículo ou harmina (0,1 μM ou 0,3 μM). Os ratos WKY e SHR foram tratados com harmina (10 mg/kg, i.p.) ou veículo, diariamente após o desmame até o 38º dia pós-natal (DPN), e testados na arena de campo aberto, no teste de reconhecimento de objetos (RO), labirinto em Y e marble burying. Através da marcação com a MAP-2 aos 2 DIV, o percentual de neurônios WKY com zero ramificações diminuiu (n=6, t=2,38; P < 0,05), e o percentual com 2-3 pontos de ramificação aumentou após 24h de incubação com harmina (0,3 μM) (n=6, t=2,533; P < 0,05). Nos neurônios do modelo animal do TDAH (SHR), a harmina (0,3 μM) aumentou o percentual com 5 ou mais pontos de ramificação (n=6, t=2,562; P < 0,05). A marcação com a β-tubulina evidenciou o efeito da harmina na diminuição no percentual de neurônios WKY com 0 raízes (n=5-7, t=3,559, P < 0,05). A harmina não afetou o comprimento do maior neurito ou total dos neuritos. Além disso, não interferiu na ativação dos neurônios de nenhuma das linhagens. A hiperatividade observada nas fêmeas SHR foi revertida pela harmina (n=4-8, P < 0,05). No entanto, prejudicou o desempenho dos animais nas tarefas do RO (n=4-8, P < 0,05) e do labirinto em Y. No marble burying, não houveram alterações significativas. Embora a harmina não tenha revertido fenótipos comportamentais do TDAH, ela promoveu maior diferenciação nos neurônios de ambas as linhagens. Este resultado sugere que estudos in vivo com doses mais baixas podem ser realizados a fim de verificar um benefício cognitivo da harmina sobre os animais do modelo.

Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) is characterized by symptoms of inattention, hyperactivity, and impulsivity. The symptomatology of the disorder is influenced by the gender of the patients, with boys showing more impulsivity and hyperactivity, while girls exhibit more inattention. The etiology of ADHD is still poorly understood, but neuroimaging studies reveal delayed cortical development in patients with ADHD, in addition to dopaminergic hypofunction and serotonergic dysfunctions. Harmine is a β-carboline component of ayahuasca, along with dimethyltryptamine (DMT). The main mechanism of action of harmine is the inhibition of monoamine oxidase A (MAO-A), an enzyme that catalyzes the oxidative deamination of monoamines such as serotonin, dopamine, norepinephrine, and epinephrine. Thus, by inhibiting MAO-A and increasing the concentration of monoamines in the synaptic cleft, harmine may attenuate symptoms of ADHD. In this study, the administration of harmine was evaluated for its effects on neuronal growth in vitro and in the behavioral phenotype of the ADHD animal model in vivo. Frontal cortex neurons from spontaneously hypertensive rats (SHR) – an experimental model of ADHD – and their control strain (WKY) were cultured with vehicle or harmine (0.1 μM or 0.3 μM). WKY and SHR rats were treated with harmine (10 mg/kg, i.p.) or vehicle daily from weaning until postnatal day 38 (PND), and tested in the open field arena, novel object recognition (NOR) test, Y maze, and marble burying test. MAP-2 staining at 2 DIV revealed a decrease in the percentage of WKY neurons with zero branching points (n=6, t=2.38; P < 0.05), and the percentage with 2-3 branching points increased after 24h incubation with harmine (0.3 μM) (n=6, t=2.533; P < 0.05). In the ADHD model neurons (SHR), harmine (0.3 μM) increased the percentage with 5 or more branching points (n=6, t=2.562; P < 0.05). β-tubulin staining demonstrated the effect of harmine in decreasing the percentage of WKY neurons with 0 roots (n=5-7, t=3.559, P < 0.05). Harmine did not affect maximal or total neurite length. Furthermore, it did not interfere with the activation of neurons in either strain. Hyperactivity observed in SHR females was reversed by harmine (n=4-8, P < 0.05). However, it impaired performance in NOR (n=4-8, P < 0.05) and Y maze tasks. In the marble burying test, no significant changes were observed. Although harmine did not reverse ADHD behavioral phenotypes, it promoted greater differentiation in neurons of both strains. This result suggests that in vivo studies with lower doses may be conducted in order to verify a cognitive benefit of harmine on the animal model.