Estudo das atividades de esfingomielinase de túbulos seminíferos de ratos imaturos

Abstract

A esfingomielinase (SMase, esfingomielina fosfodiesterase, EC 3.1.4.12) catalisa a hidrólise da esfingomielina em ceramida e fosforilcolina. Até o presente momento, dois tipos principais de atividade de Mase têm sido descritos em vários tecidos. A enzima ácida lisossomal (A-SMase) tem sua atividade máxima em pH 5,0 e está ubiquamente distribuída em tecidos de mamiferos. A enzima neutra (N-SMase), pH ótimo em 7,4 e requer Mg²⁺. Muitas izoenzimas neutras e ácidas têm sido descritas. A atividade de SMase neutra é mais elevada em cérebro do que em outros tecidos. Além do cérebro, testículos, aorta e adrenal apresentam atividade de SMase neutra moderada. O plasma seminal bovino contém uma SMase ativa em pH 6,5 que requer Mn²⁺ para ativação. Esta enzima tem uma ampla distribuição no tecido reprodutivo de bovinos e pode ser classificada como uma enzima neutra por seu óbvio requerimento por íons de metais divalentes. Neste trabalho, analisamos as atividades da SMase em túbulos seminíferos de ratos imaturos. A atividade de SMase foi determinada pela quantificação da fosforilcolina produzida. Primeiro, determinamos a dependência do pH na hidrólise da [14C]SM. O homogeneizado total de túbulos seminíferos de ratos de 19 dias tem capacidade de hidrolisar SM em uma ampla faixa de pHs, que vai de 4,8 - 8,0, com picos de atividade em pH 4,8, pH 6,6 e pH 7,4. A análise por TLC do produto da reação mostrou uma única banda radioativa que co-migra com a autêntica fosforilcolina. A seguir, analisamos em maior detalhe a atividade da enzima com pH ótimo 6,6. Com adição de 0,2% de Triton X-100 o aumento de produção de fosforilcolina é dependente do tempo e da concentração de enzima, sendo linear até 1 h e até 300 g de proteína. O Km da enzima foi determinado pelo gráfico de Lineweaver-Burk e é 30,8 μM. O Mg²⁺ não tem efeito na ativação da SMase em pH 6,6. Analisamos também a localização sub-celular das diferentes atividades de SMase. As frações microssomal e citosólica mostram atividade nos pH 4,8, pH 6,6 e pH 7,4. A atividade da enzima ácida é maior na fração citosólica. Na fração microssomal a enzima ativa em pH 6,6 é ativada por Mn²⁺. Concluindo, túbulos seminíferos de ratos imaturos contém, além das atividades de SMase com pH ótimo em 4,8 e 7,4, já bastante estudadas em vários tecidos, uma atividade de SMase com pH ótimo em 6,6 que é ativada por Mn⁺² e já descrita para tecidos reprodutivos de bovinos.