Validação da técnica de sequenciamento massivo paralelo para detecção de variantes no gene smn1 causadoras da atrofia muscular espinhal

Abstract

Introdução: A atrofia muscular espinhal (AME) é caracterizada por fraqueza muscular progressiva decorrente da degeneração dos motoneurônios do corno anterior da medula espinhal, sendo a segunda doença autossômica recessiva fatal mais comum . Pela possibilidade de ser classificada em tipos, o diagnóstico de AME precisa ser uma avaliação dos sinais clínicos associados à análise molecular. A técnica molecular usualmente utilizada para detecção da variante patogênica comum no gene SMN1 é o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Entretanto esta técnica não apresenta um bom custo benefício, devido ao tempo despendido para execução quando utilizada em larga escala em populações de baixo risco. Outros grupos de pesquisa já estão pesquisando sobre a técnica de sequenciamento massivo paralelo (SMP) como uma metodologia de triagem, pois além de identificar doentes e portadores, esta técnica permite a inclusão de outros genes no mesmo ensaio, sendo promissora no contexto de triagem molecular de doenças genéticas e na busca por modificadores moleculares de fenótipo da doença. Objetivo: Validar o SMP para identificação de variantes patogênicas no SMN1 , tanto grandes deleções quanto variações de nucleotídeos únicos e pequenas inserções. Métodos: Realização de estudo de acurácia diagnóstica do SMP de painel contendo os genes SMN1 e SMN2 e os genes controle (potencialmente modificadores do fenótipo) NCALD e PLS3 pela plataforma Ion Torrent (S5), em pacientes com genótipo previamente definido por MLPA, divididos entre os grupos homozigotos para deleção comum no SMN1 , portadores (heterozigotos) e homozigotos normais. Resultados: O estudo de acurácia foi realizado em 49 das 50 amostras (8 homozigotos para deleção comum, 20 heterozigotos e 21 homozigotos normais). A discriminação entre casos com AME (zero cópias de SMN1 ), e não afetados, portadores (1 cópia SMN1 ) e controles (2 cópias SMN1 ) foi possível através da normalização de profundidade de leituras com gene controle NCALD . A acurácia (área sob a curva, AUC) para diferenciação entre casos e portadores foi de 1.0 (IC95% 1.0 a 1.0, p<0.001), para diferenciação entre casos e controles foi de 1.0 (IC95% 1.0 a 1.0, p<0.001) e para a diferenciação entre portadores e controles foi de 0.864 (IC95% 0.74 a 0.989, p<0.001). A acurácia para quantificação do número de cópias do gene SMN2 não foi estatisticamente significativa, exceto na diferenciação de sujeitos com 0 e 4 cópias do SMN2 em relação àqueles com 1, 2 ou 3 cópias deste gene. O painel também foi capaz de identificar a variante p.Gln154* no S MN1/SMN2 em dois nos pacientes com heterozigose composta e a variante modificadora c.859G>C no SMN2 foi coberta pelo painel. Conclusão: O painel de SMP contendo amplicons específicos do SMN1 e SMN2 e apenas utilizando 1 gene normalizador foi capaz de diferenciar com acurácia de 100% indivíduos homozigotos para a deleção comum do SMN1 (afetados), de indivíduos portadores e controles. A acurácia para diferenciação entre portadores e controles bem como para quantificação do número de cópias do SMN2 não foi considerada adequada. Desta forma, o estudo realizou a validação de um painel de SMP como exame de triagem diagnóstica para AME com custo muito inferior aos testes com SMP disponíveis atualmente (que utilizam centenas de genes controles) que poderá ser uma ferramenta de menor custo útil no contexto de programas de triagem neonatal. Entretanto este teste não parece ser adequado como exame de confirmação diagnóstica por não diferenciar satisfatoriamente casos e portadores.

Introduction: Spinal Muscular Atrophy (SMA) is characterized by progressive muscle weakness due to the degeneration of motor neurons in the anterior horn of the spinal cord. It is the second most common fatal autosomal recessive disease. Due to the possibility of being classified into types, the diagnosis of SMA requires an evaluation of clinical signs associated with molecular analysis. The molecular technique usually used for detecting the common pathogenic variant in the SMN1 gene is Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). However, this technique does not present good cost-effectiveness due to the time required for execution when used on a large scale in low-risk populations. Other research groups are already investigating the technique of massive parallel sequencing (MPS) as a screening methodology because, in addition to identifying patients and carriers, this technique allows for the inclusion of other genes in the same assay. This is promising in the context of molecular screening for genetic diseases and in the search for molecular modifiers of the disease phenotype. Objective: To validate MPS for the identification of pathogenic variants in SMN1 , including large deletions, single nucleotide variations, and small insertions. Methods: A diagnostic accuracy study of the MPS panel containing the S MN1 and SMN2 genes and the control genes (potential phenotype modifiers) N CALD and PLS3 was conducted using the Ion Torrent (S5) platform in patients with previously defined genotypes by MLPA. These patients were divided into groups of homozygotes for the common deletion in SMN1 , carriers (heterozygotes), and normal homozygotes. Results: The accuracy study was conducted on 49 out of 50 samples (8 homozygotes for the common deletion, 20 heterozygotes, and 21 normal homozygotes). Discrimination between SMA cases (zero copies of SMN1 ), unaffected individuals, carriers (1 copy of SMN1 ), and controls (2 copies of SMN1 ) was possible through the normalization of read depth with the control gene NCALD. The accuracy (area under the curve, AUC) for differentiating between cases and carriers was 1.0 (95% CI 1.0 to 1.0, p<0.001), for differentiating between cases and controls was 1.0 (95% CI 1.0 to 1.0, p<0.001), and for differentiating between carriers and controls was 0.864 (95% CI 0.74 to 0.989, p<0.001). The accuracy for quantifying the number of copies of the SMN2 gene was not statistically significant, except in the differentiation of subjects with 0 and 4 copies of SMN2 compared to those with 1, 2, or 3 copies of this gene. The panel was also able to identify the p.Gln154 variant in SMN1/SMN2 in two patients with compound heterozygosity, and the modifying variant c.859G>C in SMN2 was covered by the panel. Conclusion: The MPS panel containing specific amplicons of SMN1 and SMN2 and using only one normalizing gene was able to accurately differentiate 100% of homozygous individuals for the common SMN1 deletion (affected) from carriers and controls. The accuracy for differentiating between carriers and controls, as well as for quantifying the number of copies of SMN2 , was not considered adequate. Thus, the study validated an MPS panel as a diagnostic screening test for SMA with a much lower cost compared to currently available MPS tests (which use hundreds of control genes), which could be a useful low-cost tool in the context of neonatal screening programs. However, this test does not seem to be adequate as a confirmatory diagnostic test because it does not satisfactorily differentiate cases and carriers.