Clonagem e expressão de um gene da família Cry1A de Bacillus thuringiensis em Escherichia coli

Abstract

Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva, entomopatogênica, aeróbia e amplamente utilizada como biopesticida para controle de insetos-praga de culturas importantes. Estas bactérias são encontradas normalmente no solo, na superfície de folhas e também como patógenos de muitos insetos. Elas são capazes de se manter em latência, sob forma de endósporos, em condições adversas. Durante a fase de esporulação, as bactérias sintetizam proteínas que se acumulam na periferia dos esporos sob forma de cristais. Estes cristais são compostos por aglomerados de proteínas Cry inativas, sob a forma de protoxinas de 130 kDa, também chamadas de delta-endotoxinas. As proteínas Cry são tóxicas para membros da classe Insecta, bem como para outros invertebrados, como membros do filo Nematoda. Esse trabalho teve como objetivos a clonagem e a expressão de um gene pertencente à família Cry1A da linhagem UNI498 de Bacillus thuringiensis, isolada do solo do Rio Grande do Sul. Um fragmento de aproximadamente 1900 pb, correspondendo às regiões amino e central da proteína Cry, foi amplificado por PCR usando iniciadores especificamente projetados. Este fragmento foi clonado em pGEM® T-Easy e quase totalmente sequenciado. A sequência de nucleotídeos obtida, bem como a de aminoácidos, foi comparada com sequências de genes e proteínas da família Cry1A disponíveis no GenBank. Uma alta identidade foi observada entre as sequências do fragmento amplificado e sequências pertencentes à subfamília Cry1Aa. Análises filogenéticas corroboraram a classificação do gene isolado da linhagem Bt UNI498 como pertencente a essa subfamília. Tentativas de expressar a proteína Cry1Aa isolada em E. coli foram realizadas utilizando-se os vetores de expressão pGEX e pET23a, sem resultados positivos. Novas clonagens estão em andamento a fim de se obter um extrato protéico de E. coli com a nova proteína Cry1Aa, para posteriores bioensaios de toxicidade em lagartas de Anticarsia gemmatalis.

Bacillus thuringiensis is a Gram-positive entomopathogenic aerobic bacterium widely used as biopesticide to control plague insects of important crops. These bacteria are usually found in soil, leaf surface and also as pathogens to several insects. They are able to present a latent endospore form under adverse conditions. During the sporulated phase, the bacteria synthesize proteins that accumulate in cell periphery as crystals. These crystals are composed of inactive Cry proteins in the form of 130 kDa protoxins, also known as delta-endotoxins. Cry proteins are specifically toxic for some insects and nematodes. This work aimed the cloning and expression of a Bacillus thuringiensis strain UNI498 Cry1A gene family member, which was isolated from soils of Rio Grande do Sul state. A fragment of approximately 1900 bp, corresponding to the amino and central regions of the Cry protein, was PCR amplified using specifically designed initiators. This fragment was cloned into pGEM® T-Easy vector and almost completely sequenced. The nucleotide and amino acid sequences obtained were compared to Cry1A gene family sequences available at GenBank database. A high identity between the amplified fragment sequences and the Cry1Aa subfamily sequences was observed. Phylogenetic analyses corroborated the classification of the isolated gene from Bt UNI498 as belonging to the Cry1Aa subfamily. Expression of the isolated Cry1Aa protein in Escherichia coli using pGEX or pET23a expression vectors was unsuccessful. New cloning attempts are underway to obtain an E. coli protein extract containing the new Cry1Aa protein to be further used in toxicity assays against Anticarsia gemmatalis larvae.