Aspectos tecnológicos para o aprimoramento da mitoterapia

Abstract

A mitoterapia é uma técnica recente que busca, através da administração de mitocôndrias funcionais isoladas, reverter disfunções celulares em uma variedade de condições patológicas - como isquemias pulmonar, cardíaca e cerebral, doença de Parkinson, esquizofrenia e declínio cognitivo. Em modelos celulares, animais e humanos, essa estratégia já demonstrou potencial de recuperação do perfil metabólico, reversão do estresse celular e de danos teciduais. No entanto, diversos são os parâmetros que ainda limitam a sua aplicabilidade. Em virtude da diversidade dos modelos celulares utilizados e métodos empregados - como por exemplo, o protocolo de isolamento mitocondrial - a estratégia terapêutica carece de técnicas padronizadas que garantam com satisfatória reprodutibilidade a obtenção de seus benefícios potenciais. O presente trabalho propõe explorar aspectos tecnológicos da mitoterapia, buscando contribuir para o seu aprimoramento e aplicabilidade. Para isso, foi estabelecido um modelo de degeneração in vitro utilizando cultivo de células de neuroblastoma humano Be(2)-M17, desafiadas com 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Utilizamos a marcação com a sonda JC-1 para estabelecer o início da disfunção mitocondrial nas células tratadas, e como parâmetro para a administração de diferentes quantidades terapêuticas de mitocôndrias autólogas. Avaliamos diferentes protocolos de isolamento mitocondrial, buscando o estabelecimento de melhor rendimento e qualidade, utilizando de técnicas de dosagem protéica (com o método de BCA) e de Respirometria de Alta Resolução (Oxígrafo Oroboros O2k). O protocolo que promoveu o isolamento de mitocôndrias de células de neuroblastoma humano com perfil respiratório adequado demonstrou boa reprodutibilidade em termos de rendimento, porém o mesmo desempenho não pôde ser observado quando o método de isolamento foi testado com a linhagem de células-tronco mesenquimais. Foi estabelecido como tratamento de referência o transplante autólogo com diferentes doses terapêuticas de mitocôndrias de neuroblastoma humano em culturas do mesmo tipo celular, desafiadas com o modelo de degeneração com a 6-OHDA. Nenhuma das doses avaliadas apresentaram efeito regenerativo nas células tratadas. Ainda, a dose mitocondrial mais elevada (13x a concentração de mitocôndrias estimadas no poço para o tipo celular testado) potencializou o efeito do agente estressor. A avaliação da capacidade terapêutica da mitoterapia, com análise comparativa e validação dos métodos, sustenta a importância da otimização tecnológica, possibilitando com a confiabilidade necessária a aplicação da técnica na modulação da sobrevivência celular em diversas condições patológicas.

Mitotherapy is a recent technique that seeks, through the administration of functional mitochondria, the regression of cellular dysfunctions in a variety of pathological conditions – such as pulmonary, cardiac and cerebral ischemia, Parkinson’s disease, schizophrenia and cognitive decline. In models in vitro and in vivo, this strategy has already demonstrated the potential for recovery of the metabolic state, reversal of cellular stress and tissue damage. However, there are several parameters that still limit its applicability. Due to the diversity of cell models and methods used - such as the mitochondrial isolation protocol - the therapeutic strategy lacks standardized techniques that guarantee, in a satisfactory and reproducible way, the achievement of its potential benefits. The present work proposes to explore technological aspects of mitotherapy, to contribute to its improvement and applicability. For this, it was established a model of degeneration in vitro using the neuroblastoma human line cell Be(2)-M17 human neuroblastoma cells, challenged with 6-hydroxydopamine (6-OHDA). It was used JC-1 probe to establish the onset of mitochondrial dysfunction in cells incubated with 6-OHDA, and as a parameter for the beginning of the treatment with autologous mitochondria. It was evaluated different mitochondrial isolation protocols, to establish better yield and quality, using protein dosage techniques (with the BCA method) and High Resolution Respirometry (Oroboros O2k Oxygraph). The protocol that promoted the isolation of mitochondria from human neuroblastoma cells with adequate respiratory performance demonstrated good reprodutibility in terms of yield, but the same performance could not be observed When the isolation method was tested with the mesenchymal stem cell line. As a reference treatment, it was established the autologous transplantation with different therapeutic doses of human neuroblastoma mitochondria in cultures of the same cell type, challenged with the 6-OHDA degeneration model. None of the doses evaluated showed a regenerative effect on the treated cells. Furthermore, the highest mitochondrial dose (13x the estimated mitochondria concentration in the well for the cell type tested) potentiated the effect of the stressor. The evaluation of mitotherapy’s therapeutic capacity, with comparative analysis and validation of the methods, supports the importance of technological optimization, allowing the application of the technique with reliability in the modulation of cell survival in different pathological conditions.