Efeito do canabidiol na modulação do sistema endocanabinoide em modelo pré-clínico de neurônio maduro e de desenvolvimento neuronal

Abstract

O canabidiol (CBD) é um fitocanabinoide derivado da Cannabis sativa utilizado no tratamento de distúrbios neurológicos, incluindo epilepsias refratárias infantis. Há evidências positivas de seu uso, mas pouco se sabe sobre efeitos a longo prazo no sistema nervoso em desenvolvimento, já que é capaz de interagir com o receptor canabinoide 1 (CB1) do sistema endocanabinoide (SEC), que regula o neurodesenvolvimento. Neste trabalho, avaliamos níveis de expressão de enzimas e receptores do SEC - CNR1 (Receptor canabinoide tipo 1), CNR2 (Receptor canabinoide 2), DAGLA (Diacilglicerol lipase alfa), MAGL (Monoacilglicerol lipase), NAPEPLD (N-araquidonoil fosfatidiletanolamina fosfolipase-D) e FAAH (Amida hidrolase de ácidos graxos) - em resposta ao tratamento com CBD em neurônios maduros e no desenvolvimento neuronal. Para isso, células da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram diferenciadas em um fenótipo neuronal com ácido retinóico (AR) durante 7 dias. Para a avaliação dos efeitos do CBD em neurônios maduros, as células foram tratadas por 24h ao final da diferenciação. Já para a avaliação dos efeitos do CBD durante o desenvolvimento neuronal, o mesmo foi adicionado a cada troca de meio durante os 7 dias de diferenciação. Após os tratamentos, amostras foram coletadas em Trizol (Invitrogen) para extração de RNA de acordo com a orientação do fabricante. Em seguida realizou-se a síntese de cDNA que foi utilizado para a quantificação dos níveis de expressão dos genes por RT-qPCR, quantificados pelo método 2-ΔCt. Também avaliamos efeitos neuroprotetores / neurotóxicos do CBD e seus derivados sintéticos HUF-101, (-) -5′-DMH-CBD e HU-556 em células tratadas por 24h (neurônios maduros) ou durante a diferenciação neuronal e co-tratadas com 0,375 mM de Peróxido de Hidrogênio por mais 24h. Também avaliamos os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos do CBD e seus derivados quando desafiados com 6-OHDA após as 24h do 7° dia de tratamento. Ambos os desafios foram avaliados a viabilidade celular por MTT e a produção de espécies reativas de oxigênio por DCF. Neste trabalho utilizamos uma dose de 0,1 μM de CBD e derivados sintéticos visto que demonstrou certa proteção. Os resultados indicam que neurônios maduros e em desenvolvimento respondem de forma diferente ao CBD tanto em nível celular quanto molecular. O CBD atua no sistema endocanabinoide (SEC), um sistema de mensageiros retrógrados, que produz endocanabinoides como 2-AG (2-araquidonoilglicerol) e AEA (Anandamida). Nosso trabalho apresentou uma redução na expressão da enzima que sintetiza AEA e houve um aumento na expressão da enzima que degrada AEA no modelo de desenvolvimento neuronal, e isso faz com que tenha uma menor disponibilidade de AEA que é um ligante de CB1. O efeito neuroprotetor não é o mesmo quando submetemos as células tratadas com CBD a um desafio mais intenso de H2O2 (Peróxido de hidrogênio), mas é neuroprotetor durante a diferenciação quando desafiado com 6-OHDA.

Cannabidiol (CBD) is a phytocannabinoid derived from Cannabis sativa used in the treatment of neurological disorders, including refractory childhood epilepsies. There is positive evidence for its use, but little is known about its long-term effects on the developing nervous system, as it is able to interact with the cannabinoid receptor 1 (CB1) of the endocannabinoid system (ECS), which regulates neurodevelopment. In this work, we evaluated expression levels of ECS enzymes and receptors - CNR1 (Cannabinoid receptor type 1), CNR2 (Cannabinoid receptor type 2), DAGLA (Diacylglycerol lipase alpha), MAGL (Monoacylglycerol lipase), NAPEPLD (N-arachidonoylphosphatidylethanolamine phospholipase-D) and FAAH (Fatty acid amide hydrolase) - in response to CBD treatment in mature neurons and in neuronal development. For this, cells of the human neuroblastoma lineage SH-SY5Y were differentiated into a neuronal phenotype with retinoic acid (RA) for 7 days. To evaluate the effects of CBD on mature neurons, cells were treated for 24h at the end of differentiation. For the evaluation of the effects of CBD during neuronal development, it was added to each change of medium during the 7 days of differentiation. After the treatments, samples were collected in Trizol (Invitrogen) for RNA extraction according to the manufacturer's instructions. Then, cDNA synthesis was performed, which was used to quantify gene expression levels by RT-qPCR, quantified by the 2-ΔCt method. We also evaluated neuroprotective / neurotoxic effects of CBD and its synthetic derivatives HUF-101, (-)-5′-DMH-CBD and HU-556 in cells treated for 24h (mature neurons) or during neuronal differentiation and co-treated with 0.375 mM of Hydrogen Peroxide for another 24h. We also evaluated the neuroprotective/neurotoxic effects of CBD and its derivatives when challenged with 6-OHDA after 24h of the 7th day of treatment. Both challenges were evaluated for cell viability by MTT and production of reactive oxygen species by DCF. In this work, we used a dose of 0.1 μM of CBD and synthetic derivatives as it showed some protection. The results indicate that mature and developing neurons respond differently to CBD at both a cellular and molecular level. CBD acts on the endocannabinoid system (ECS), a retrograde messenger system, which produces endocannabinoids such as 2-AG (2-arachidonoylglycerol) and AEA (Anandamide). Our work showed a reduction in the expression of the enzyme that synthesizes AEA and there was an increase in the expression of the enzyme that degrades AEA in the neuronal development model, and this causes a lower availability of AEA, which is a CB1 ligand. The neuroprotective effect is not the same when we subject the CBD-treated cells to a more intense challenge with H2O2 (Hydrogen Peroxide), but it is neuroprotective during differentiation when challenged with 6-OHDA.