Análise da viabilidade das células adiposas criopreservadas : perspectivas clínicas quanto sua aplicação na reconstrução mamária

Abstract

O enxerto de gordura autólogo ou lipoenxertia tem sido considerado um dos principais procedimentos para correção de perdas de volume, forma, projeção e sensibilidade da mama, com melhora dos resultados cosméticos após cirurgias conservadoras da mama (seguidas de radioterapia) e reconstrutoras com a utilização de implantes ou retalhos miocutâneos após mastectomia. A viabilidade do enxerto de gordura autólogo armazenado a longo prazo, a partir de um protocolo específico e apropriado de criopreservação permanece desconhecida. Objetivo: Avaliar a viabilidade do enxerto de gordura autóloga, obtido conforme a técnica de Coleman, após a criopreservação das células adiposas com dois diferentes esquemas de agentes crioprotetores em dois diferentes tempos de criopreservação e desenvolver um protocolo padrão de criopreservação do tecido adiposo. Métodos: 12 pacientes do sexo feminino, submetidas à cirurgia da mama com lipoenxertia, foram selecionadas consecutivamente para participar deste estudo de não-inferioridade, conduzido no Serviço de Mastologia e no Centro de Pesquisa Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram coletadas de cada paciente amostras de 30ml de gordura do abdome inferior conforme a técnica de Coleman. No grupo 1, 5ml do enxerto de gordura fresca, não criopreservado, de cada paciente serviu como grupo controle. No grupo 2, os agentes crioprotetores dimetilsulfóxido e trealose foram adicionados às amostras de 10ml do enxerto de gordura fresca das mesmas pacientes. No grupo 3, o crioprotetor trealose foi adicionado as outras amostras de 10ml do enxerto de gordura fresca destas pacientes. Os enxertos de gordura com os agentes crioprotetores (grupos 2 e 3) foram submetidos a um congelamento lento e gradual até -196oC e um aquecimento rápido. Os enxertos de gordura fresco e criopreservado, em cada grupo, foram avaliados a partir da contagem de células adipócitas viáveis com azul trypan, da análise da atividade enzimática de glicerol-3-fosfato desidrogenase e da histologia (hematoxilina e eosina). As amostras de enxerto de gordura criopreservado (grupos 2 e 3) foram testadas em dois momentos diferentes, uma vez estabilizadas em nitrogênio líquido, em torno de 20 min e após 6 meses em nitrogênio líquido. Os resultados das análises do enxerto de gordura criopreservado (grupos 2 e 3) foram comparados com os resultados do enxerto de gordura fresco (grupo 1) nos diferentes tempos de criopreservação. Os resultados obtidos foram avaliados quanto a sua distribuição de normalidade e utilizados os testes estatísticos adequados para comparação entre os grupos. Um valor-P menor que 0.05 foi considerado estatisticamente significativo (P < 0.05). A contagem de células viáveis pelo azul trypan encontrada foi similar em todos os três grupos após 20 minutos e 6 meses de criopreservação (p 0.156 and p 0.410). A atividade enzimática da glicerol- 3-fosfato desidrogenase manteve-se preservada após 6 meses de criopreservação (p 0.189). Histologicamente, a avaliação do tecido adiposo não teve diferença em todos os grupos. O enxerto de gordura autólogo coletado, baseado na técnica de Coleman, e criopreservado com estes dois diferentes agentes crioprotetores conservou sua viabilidade, estrutura e funcionalidade. Os resultados encorajadores justificam que mais pesquisas sejam feitas para refinar este protocolo de criopreservação e evoluir para futuros projetos de estudos in vivo.

Autologous fat grafting or lipofilling has been considered one of the main procedures for correction of breast volume, shape, projection, and sensitivity loss, with a better cosmetic outcome after breast conservative surgeries (followed by radiotherapy) and implants or myocutaneous flap reconstruction after mastectomy. The viability of long-term storage of autologous fat graft from a specific and appropriate cryopreservation protocol remains unknown. Objective: Analyze the viability of autologous fat grafts harvested with the Coleman technique after application of a protocol with two different methodologies of cryoprotective agents at different storage times and develop a standard cryopreservation protocol for adipose tissue. Methods: Twelve (12) adult female patients were enrolled consecutively in this non-inferiority study conducted at the Breast Unit and Experimental Research Center of Hospital de Clínicas de Porto Alegre. In each patient, 30ml of fat graft was harvested with the Coleman technique from the lower abdomen. In group 1, 5 ml of fresh fat grafts without cryopreservation from each patient served as a control. In group 2, 10 ml of fresh fat grafts from the same patients was mixed with cryoprotective agents dimetil sulfoxide and trehalose. In group 3, 10 ml of fresh fat grafts was mixed with trehalose. The fat grafts with cryoprotective agents underwent cryopreservation with controlled slow cooling to -196oC and fast rewarming. Fresh and cryopreserved fat graft in each group were analyzed by viable adipocyte counts with trypan blue vital staining, glycerol-3- phosphate dehydrogenase assay and histology (hematoxylin and eosin). The cryopreserved fat graft samples (groups 2 and 3) were tested at two different moments, once they became stabilized in liquid nitrogen for about 20 minutes and after 6 months. The cryopreserved fat grafts analysis results (groups 2 and 3) were compared with the fresh fat grafts results (group 1). The distributions for normality were analyzed and the appropriate statistical tests were used to analyze the difference between the groups. A P-value less than 0.05 was considered statistically significant (P <0.05). Viable adipocyte counts were found similar in all groups at 20min and 6 months of cryopreservation (p 0.156 and p 0.410). The glycerol-3-phosphatase dehydrogenase activity was maintained in all groups after 6 months of cryopreservation (p 0.189). Histologically, fatty tissue assessment had no difference in all groups. The autologous fat grafts harvested based on Coleman technique and cryopreserved with these two different methodologies of cryoprotective agents maintained its viability, structure, and functionality. The encouraging results justify that further research be carried out to refine this cryopreservation protocol and support subsequent in vivo trials.