Estudo de queratinase de bacillus subtilis como agente depilatório e romotor de absorção para uso tópico em humanos

Abstract

O presente trabalho iniciou com a caracterização de 19 bactérias isoladas em meio seletivo contendo farinha de pena seguido da seleção de seis cepas com elevada atividade queratinolítica. Os seis microrganismos selecionados foram denominados de NP4, NP5, NP8, FCA1, FCA3 e FCA8. Os mesmos foram cultivados em diferentes meios de cultivo: fios de cabelo humano (CB), farinha de pena (FP) e Luria-Bertani e seus sobrenadantes foram ensaiados frente aos substratos azoqueratina e azul de queratina. Desse rastreamento, o isolado NP5, Bacillus subtilis, foi o que teve maior atividade queratinolítica e foi o escolhido para o prosseguimento do estudo. A Influência de parâmetros nutricionais e físico-químicos na produção enzimática foi avaliada e as condições finais de cultivo foram: inoculo de 10[sobrescrito 8] células de NP5 em meio com 7,5% de farinha de pena e 0,05% de extrato de levedura em água deionizada, em 72 horas, a 37 ◦C e 180 rpm. Nessas condições de cultivo obtivemos uma atividade de 4,91 ± 0,30 U.h.min-1. A seguir, a atividade queratinolítica do sobrenadante foi avaliada antes e após incorporação em quatro veículos de uso dermatológico: Gelcreme Sepigel®, Gel Aristoflex® AVC, Gel Carbopol® e Gel Goma xantana®. Com base nas atividades obtidas, o veículo dermatológico escolhido foi o gelcreme sepigel e o mesmo foi utilizado para os testes in vitro, em Célula de Franz Modificada, e in vivo, em camundongos. Nos experimentos em Célula de Franz Modificada, a formulação enzimática mostrou ser capaz de promover maior penetração de diclofenaco sódico no estrato córneo nos tempos de 15 minutos e 1 hora após o tratamento. No experimento in vivo, 4 grupos de animais foram ensaiados: enzima, papaína, veículo e controle. Os grupos tratados com enzima e papaína apresentam áreas pilosas falhadas em comparação aos grupos veículo e controle e, na formulação gelcreme, o extrato enzimático se mostrou mais eficiente no efeito depilatório do que a papaína. Ainda dentro desse experimento aguardamos os resultados das análises histológicas do pulmão, baço, coração, fígado, cérebro, rins e da pele para a avaliação final.

This work began with the characterization of 19 bacteria isolated in selective medium containing feather meal followed by the selection of six strains with keratinolytic activity noted. The six selected microorganisms were designated NP4, NP5, NP8, FCA1, FCA3 and FCA8. They were grown in different culture media: human hair (CB), feather meal (FM) and Luria-Bertani and their supernatants were tested against the azokeratin and Keratin azure®. After this screening, the NP5, a Bacillus subtilis, presented the higher keratinase activity and was chosen for further study. The influence of nutritional parameters and physico-chemical in enzyme production was evaluated and the final conditions of cultivation were: inoculum for NP5 10[superscript 8] cells in medium with 7.5% feather meal, and 0.05% yeast extract in deionized water in 72 hours at 37 ◦C and 180 rpm. In these culture conditions we obtained an activity of 4.91 ± 0.30 U.h.min-1. Afterwards the keratinolytic activity of the supernatant was measured before and after incorporation into four distinct vehicles for dermatological use: Sepigel® Gelcreme, Aristoflex AVC® Gel, Carbopol® Gel and Xanthan gum® Gel. Based on the activities obtained from the dermatological vehicle Sepigel Gelcreme® was chosen and it was used for the tests in vitro, in Modified Franz cell, and in vivo in mice. From the experimental results in Modified Franz cell, the enzyme formulation was able to exert action on the penetration of diclofenac sodium in the stratum corneum after 15 minutes and 1 hour, after treatment. In in vivo experiment, four groups of animals were tested: enzyme, papain, and vehicle control. Groups treated with the enzyme and papain have more failed hairy areas compared to control groups and vehicle, and the formulation gelcreme the enzymatic extract is more efficient than the effect depilatory papain. Also within this experiment we await the results of histological analyzes of lung, spleen, heart, liver, kidneys, brain and skin for the final evaluation.