Caracterização da composição do lisado plaquetário

Abstract

A cultura de células in vitro utiliza diversas formulações de meios de cultura, os quais contém uma fonte de fatores de crescimento; o padrão ouro atualmente utilizado para essa finalidade é o soro fetal bovino (SFB). Entretanto, existem alternativas melhores que superam sua eficácia e limitações. O uso do suplemento lisado plaquetário (LP) humano como substituto do SFB na cultura de células-tronco mesenquimais (CTM) humanas, por exemplo, é particularmente importante pois elimina o risco de xenorreação em pacientes tratados com essas células, além de evitar a transmissão de zoonoses, como a encefalopatia espongiforme bovina. Diversas agências regulatórias como a Organização Mundial da Saúde solicitaram a não utilização de suplementos de origem animal na manipulação de produtos biológicos que têm como finalidade a terapia em humanos. Produzido a partir de bolsas de plaquetas humanas descartadas pelo banco de sangue devido ao prazo de validade, o lisado plaquetário é uma fonte alternativa de fatores de crescimento atualmente viável, sustentável e segura para cultivo celular. Ele promove crescimento acelerado de CTMs em especial, permitindo a obtenção de uma dose terapêutica em menos tempo, mantendo características celulares imunofenotípicas e diferenciativas. A análise do conteúdo desse suplemento, porém, carece de dados, já que ele é preparado in-house, com variações dependendo do protocolo utilizado, sendo muitos protegidos por patente. Sabe-se que a ativação e rompimento das plaquetas no processo de coagulação sanguínea promove a liberação de mais de trezentas moléculas intracelulares em grânulos heterogêneos para o sangue, orquestrando diversas funções fisiológicas, como regeneração tecidual e angiogênese. No Centro de Processamento Celular Avançado (CPCA) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre é utilizada grande quantidade de LP para diversos ensaios clínicos. Este trabalho busca, portanto, caracterizar a composição desse produto por metodologias não convencionalmente descritas na literatura, ao passo em que permite futuras investigações sobre seu modo de ação. Através da dosagem de proteínas totais foi observado que o LP possui 49,57 ± 3,65 mg/mL, concentração significativamente maior que o SFB (30,54 ± 1,76 mg/mL); além disso, a análise proteômica por ontologia gênica e função proteica identificou proteínas relacionadas a proliferação, morfogênese, diferenciação, biossíntese, adesão e metabolismo celular, que estão sendo possivelmente metabolizadas ou recicladas pelas células. Ainda, foram detectadas proteínas responsáveis pela ligação e ativação dos fatores de crescimento TGF-β, HGF e IGF. Na análise de partículas por espalhamento dinâmico de luz observou-se a presença de um perfil heterogêneo e polidisperso de partículas, com dois padrões populacionais em 231 ± 96 d.nm com 61% de intensidade e em 30 ± 8 d.nm com 26% de intensidade; sendo possivelmente agregados proteicos ou distintas populações de vesículas, um importante meio de transporte de proteínas no microambiente celular. A realização de estudos como esse contribui essencialmente para a indústria biomédica, fornecendo dados para a melhor compreensão de diversos mecanismos moleculares envolvidos em terapia celular, impulsionando tecnologias na área da saúde e oferecendo alternativas melhores de tratamento para diversas patologias.

In vitro cell culture make use of several culture media formulations, that contain a source of growth factors; the gold standard currently used to this aim is fetal bovine serum (FBS). However, there are better alternatives that outweigh its effectiveness and limitations. The use of human platelet lysate (PL) as a substitute for FBS in human mesenchymal stem cell (MSC) culture is particularly important because it eliminates the xenoreaction risk in patients treated with these cells, as well as avoiding the zoonosis transmission, like bovine spongiform encephalopathy. Several health regulatory agencies such as the World Health Organization requested that animal origin supplements are not to be utilized in the manipulation of biological products purposed as therapy in humans. Made from expired human platelet bags discarded by the blood bank, the platelet lysate is an alternative source of growth factors actually viable, sustainable and safe to cell culture. It promotes MSCs faster growth in particular, allowing to achieve the required therapeutic dose in a shorter period of time, maintaining the immunophenotypic and differential cellular characteristics. The analysis of this supplement content, besides, lack data, since it is prepared in-house, with variations according to the utilized protocol, many being patent protected. It is known that the platelet activation and lysis in the blood coagulation process promote the release of more than three hundred intracellular molecules contained in heterogeneous granules to the bloodstream, which coordinate many physiological functions like tissue regeneration and angiogenesis. At the Advanced Cellular Processing Center (CPCA) from the Hospital de Clínicas de Porto Alegre, a large amount of PL is utilized in several clinical trials. This work aim, therefore, to characterize this product composition by unconventional literature-described methodologies, while allowing further investigations about its mechanism of action. Through total protein quantification, it was observed that PL has 49,57 ± 3,65 mg/mL, a significant higher amount than FBS (30,54 ± 1,76 mg/mL); besides, the proteomics analysis by gene ontology and protein function identified proteins related to cellular proliferation, morphogenesis, differentiation, biosynthesis, adhesion and metabolism, which are possibly being metabolized or having its structure recycled by cells. Also, several proteins responsible for activating and binding of the growth factors TGF-β, HGF and IGF were detected. Particle analysis through dynamic light scattering showed a heterogeneous and polydisperse profile of particles, with two population patterns at 231 ± 96 d.nm with 61% of intensity and at 30 ± 8 d.nm with 26% intensity; possibly being protein aggregates or distinct vesicle populations, an important way of protein transportation through the cellular microenvironment. Making studies like this one contribute essentially to the biomedical industry, with data to better comprehend several molecular mechanisms involved in cellular therapy, pushing healthcare technologies forward and offering patients better treatment options for several pathologies.