Análise de interneurônios gabaérgicos parvalbumina-positivos e calbindina-positivos no córtex pré-frontal medial em modelo animal de autismo induzido por ácido valproico

Abstract

O transtorno do espectro autista (TEA) é uma desordem do neurodesenvolvimento que possui etiologia desconhecida, caracterizada por déficits de comunicação e de interação social, bem como padrões de comportamento, atividades ou interesses restritos e/ou repetitivos. Um conhecido fator de risco para o desencadeamento do TEA é a exposição pré-natal ao ácido valproico (VPA), o qual é utilizado para gerar características do tipo-autista em modelos animais quando administrado durante a prenhez. O desequilíbrio excitatório/inibitório (E/I) está relacionado com os prejuízos cognitivos, sociais e sensoriais encontrados no TEA, sendo que há evidências importantes da contribuição de sinalização inibitória alterada. Devido ao papelchave dos interneurônios GABAérgicos para a manutenção do balanço E/I e a importância do córtex pré-frontal medial (CPFm) para comportamentos sociais nos roedores, os objetivos deste trabalho foram analisar a quantidade e a proporção dos interneurônios GABAérgicos calbindina-positivos (CB+) e parvalbumina-positivos (PV+) em relação aos neurônios totais NeuN+ nas camadas superficiais e profundas das três regiões do CPFm: córtex cingulado anterior (aCC) e áreas pré-límbica (PrL) e infralímbica (IL). Ratas Wistar prenhes foram aleatoriamente divididas em dois grupos experimentais: Controle e VPA. No dia embrionário 12,5, salina ou VPA (600 mg/kg, i.p.) foram administrados para os grupos Controle e VPA, respectivamente. No dia pós-natal 30, o encéfalo de ratos machos da prole (n= 3-5 em ninhadas) foi removido para realização da técnica de imunofluorescência e posterior análise em microscópio confocal (CEUA-UFRGS #140367). No CPFm como um todo, o grupo VPA apresentou um aumento no número de neurônios totais NeuN+ (p=0,0086). Já na análise das sub-regiões, observou-se diminuição do número de CB+ (p=0,0278) nas camadas profundas do aCC e na proporção destes interneurônios (p=0,0255) em relação aos neurônios totais nas camadas superficiais de PrL e de IL (p=0,0173). Já em relação aos PV+, houve aumento do número (p=0,0369) e na proporção (p=0,0044) destas células nas camadas superficiais de PrL e aumento do número nas camadas profundas (p=0,0245) de PrL. Interessantemente, houve diminuição da proporção de PV+ nas camadas superficiais (p=0,0003) e profundas (p=0,0460) do aCC e nas camadas superficiais de IL (p=0,0169). Os achados sugerem que a exposição prénatal ao VPA possa estar relacionada com alterações no processo de migração dos interneurônios em direção a áreas corticais, uma vez que a composição de todos os resultados nos permitiu observar diferentes padrões de alterações específicas nas sub-regiões. Além disso, a alteração em neurônios totais NeuN+ - os quais são majoritariamente representados por neurônios piramidais - poderia demonstrar o papel do componente excitatório nesse contexto. A exposição pré-natal ao VPA conduziu a alterações pós-natais importantes no CPFm, tanto no número quanto na distribuição de interneurônios, sugerindo uma possível relação com os prejuízos sociais já observados no modelo. Estes dados contribuem para elucidar elementoschave relacionados com alterações neurais observadas no TEA, bem como na compreensão de vias envolvidas no desequilíbrio E/I.

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder with unknown etiology, characterized by deficits in social interaction and social communication, as well as patterns of restricted and/or repetitive behaviors, activities or interests. An established environmental risk factor for ASD is the prenatal exposure to valproic acid (VPA). Based on this observation, VPA in commonly used to generate autistic-like behaviors in animal models when administered during pregnancy. Excitatory/inhibitory (E/I) imbalance is related to social, cognitive and sensory impairments found in ASD and there are strong evidences of an altered inhibitory signaling contribution. Given the key role of GABAergic interneurons for the maintenance of E/I balance and, since medial prefrontal cortex (mPFC) is pivotal to social behaviors in rodents, we aimed to evaluate quantity and proportion of calbindin-positive (CB+) and parvalbuminpositive (PV+) interneurons (both GABAergic ones) on upper and deeper layers of anterior cingulate cortex (aCC) and prelimbic (PrL) and infralimbic (IL) areas, all three mPFC subregions. Pregnant Wistar rats were randomly divided into two experimental groups: Control and VPA. At embryonic day 12.5, saline or VPA (600 mg/kg, i.p.) were administered to Control and VPA group, respectively. At postnatal day 30, brain of offspring male rats (n=3-5 in litters) was removed in order to perform imunofluorescence technique and subsequent confocal microscopy analysis (CEUA-UFRGS #140367). When analyzing the whole mPFC, VPA group presented an increase in the number of total neurons NeuN+ (p= 0.0086). In subregion analysis, it was observed a decrease in the number of CB+ (p= 0.0278) at deeper layers of aCC and also in the proportion of these interneurons (p=0.0255) into total neurons scenario at upper layers of PrL and IL areas (p= 0.0173). PV+ analysis revealed an increase in number (p= 0.0369) and proportion (p= 0.0044) of these cells at upper layers of PrL, as well as an increase in the number at deeper layers of PrL (p= 0.0245). Interestingly, there was a decrease in PV+ proportion within total neurons scenario at upper (p=0.0003) and deeper layers (p= 0.0460) of aCC, as well as upper layers of IL (p= 0.0169). Taken together, these results suggest that prenatal exposure to VPA may be related to alterations of interneuron migratory process towards cortical areas, once the composition of all results allowed us to observe different patterns of specific alterations in the subregions. Besides, the alteration in the number of total neurons NeuN+, which are mostly represented by pyramidal ones, could also demonstrate the role of excitatory component in this context. Prenatal exposure to VPA led to important postnatal changes in mPFC, in both neuronal number and distribution, suggesting possible correlation with the social impairments observed in the model. These data contribute to elucidate key elements related to neural changes observed in ASD, as well as to the understanding of pathways involved in E/I imbalance.