Fração contendo alto teor de isoflavonas da soja : obtenção e multicomplexação com ciclodextrina

Abstract

O presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento de uma fração enriquecida em isoflavonas de Glycine max (soja), na forma de agliconas (IEF), e sua associação simultânea a ciclodextrina; caracterização físico-quimica da fração e dos complexos sólidos correspondentes, e avaliação de sua permeabilidade intestinal in vitro em modelo de membrana artificial paralela (PAMPA) e celular (Caco-2). Para a avaliação qualitativa e quantitativa das agliconas em diferentes matrizes, foi desenvolvido e validado um método de análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando como fase estacionária coluna Phenomenex RP-18 e como fase móvel mistura de acetonitrila:ácido trifluoracético (100:0,01, v/v). O método desenvolvido demonstrou ser rápido, versátil, preciso, seletivo, específico e aplicável à determinação do teor das agliconas presentes em diferentes matrizes. A fração enriquecida em agliconas foi obtida a partir de um extrato seco de soja, por meio de extração com etanol, seguida de hidrólise ácida dos glicosídeos, cristalização das agliconas por adição de antissolvente e purificação por recristalização em etanol. A caracterização física, fisico-química e química das isoflavonas presentes nesta fração enriquecida foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV), granulometria por difração a Laser, difratometria de raios X em pós (DRX), espectroscopia em infravermelho com tranformada de Fourier (FT-IR), ressonâcia magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H) e carbono (13C), espectroscopia na região do ultravioleta (UV), calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise por CLAE, estabilidade frente ao calor e luz ultravioleta (UVC) e solubilidade aparente em água A fração apresentou um elevado conteúdo de agliconas (próxima a 90%), baixa solubilidade em água e sensibilidade ao calor e à luz UV. A partir dessa fração, foram preparados complexos sólidos com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) empregando-se as técnicas de complexação em pasta/micro-ondas, liofolização, co-evaporação, spray drying e em micro-ondas. Os complexos sólidos preparados com HPβCD apresentaram solubilidade superior à fração e os resultados da caracterização físico-química sugerem, fortemente, a formação simultânea de complexos de inclusão e de associação entre as três isoflavonas e a HPβCD. Por fim, foi avaliada a permeabilidade intestinal in vitro dos complexos e de IEF em células Caco-2 e PAMPA. Os resultados obtidos indicam que a permeação da daidzeína e da genisteína ocorre predominantemente via transporte ativo, enquanto e permeação de gliciteína ocorre predominantemente via difusão passiva. Da mesma forma, sugere-se que a daidzeína e a genisteína possam compartilhar o mesmo sistema de transporte. A complexação de IEF com HPβCD causou um efeito negativo sobre a permeabilidade intestinal das isoflavonas, excetuando-se os complexos preparados por spray drying, os quais apresentaram uma melhora significativa da permeabilidade da genisteína (p < 0,05) e não modificaram a permeabilidade da daidzeína e gliciteína.

The present work was designed to prepare a fraction enriched with soy isoflavone aglycones (IEF) and to characterize their physicochemical properties. Subsequently, its association with cyclodextrins was evaluated and the solid complexes, obtained by different methods, were characterized. Moreover, their in vitro permeability in Caco-2 cell permeability assay and parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) was also evaluated. At first, it was necessary to develop and validated a high performance liquid chromatography (HPLC) method of analysis for the quantification of isoflavone aglycones, using a Phenomenex RP-18 column and trifluoroacetic acid 0.1% (v/v) and acetonitrile:trifluoroacetic acid (100:0.01, v/v) as mobile phase. The developed method proved to be fast, versatile, linear, precise, selective and specific in determining the content of aglycones present in different matrices. The aglycone enriched fraction was obtained, from a soybean dry extract, by extraction with ethanol followed by acid hydrolysis of the glycosides. The aglycones formed were precipitated by antisolvent addition and purified by recrystallization with ethanol. The physico-chemical characterization of the isoflavone enriched fraction was performed by the following analysis: morphology in solid state by scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), Fourier transformed-infrared spectroscopy (FTIR), proton (1H) and carbon (13C) nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), ultraviolet absorption (UV), differential scanning calorimetry (DSC), aglycone content by HPLC, particle size analysis by laser diffraction, stability against heat and ultraviolet light (UVC) and equilibrium solubility study. The fraction presented a high content of aglycones (90%), low water solubility and sensitivity to heat and UV light. From this fraction, solid complexes were prepared with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) employing the following techniques: kneading/microwave, freeze drying, co-evaporation, spray drying and microwave. Solid complexes prepared with HPβCD showed solubility higher than the fraction and the results of physicochemical characterization strongly suggest the simultaneous formation of inclusion and association complexes between HPβCD and all isoflavones. Finally, after the production and characterization of IEF/HPβCD solid complexes, the permeability of such complexes and IEF were evaluated in vitro models: Caco-2 cell and PAMPA. The results of Caco-2 and PAMPA indicate that the permeation of daidzein and genistein occur predominantly via absorptive transport, while the permeation of glycitein is predominantly via passive diffusion. The results also suggest that daidzein and genistein share the same transport system. In general, the complexation of the IF with HPβCD had a negative effect on the isoflavones intestinal permeability. The spray-drying method was the only one that did not impair daidzein and glycitein permeabilities but improved genistein permeability from IF:HPβCD complexes as compared to the respective isoflavones permeabilities from IEF.