Produção de linhagem tumoral com expressão estável de marcador da atividade de AMPK para análise temporal em células únicas

Abstract

O desenvolvimento tumoral, dentre todos os seus outros aspectos complexos, depende da adaptação celular à sua própria mudança de comportamento, fazendo com que a reprogramação do metabolismo energético tenha uma importância muito grande nesse processo. A rede de manutenção da homeostase energética celular conta com o papel de uma quinase que atua como um sensor energético, controlando os processos catabólicos e anabólicos que são necessários para que exista o equilíbrio da razão ATP/AMP: a AMPK. O papel da AMPK acaba se misturando também no campo da tumorigênese, uma vez que ela está diretamente inserida em uma rede de sinalização supressora tumoral, o que faz dela uma potencial estratégia de uso na compreensão e tratamento de tumores. O presente trabalho teve como objetivo a produção de uma linhagem tumoral transgênica com expressão estável de uma sonda-repórter que é capaz de responder à atividade da AMPK, detectável por FRET, a partir do desenvolvimento de um vetor transponível. Esse vetor foi construído a partir de uma subclonagem molecular que uniu o inserto carreador da sonda-repórter ao backbone que carrega a maquinaria de inserção cromossomal do sistema piggyBac. O resultado dessa produção disponibiliza uma nova alternativa para a análise da relação do papel da AMPK dentro da sobrevivência tumoral, uma vez que pode ser feita a longo prazo, devido a sua expressão estável, e a nível de células individuais.

The tumorigenisis, among all its other complex aspects, depends on the cellular adaptation to it’s own change of behavior, making the metabolic reprogramming very important in this process. The maintenance network of the cellular energetic homeostasis depends on the role of a kinase that acts as an energetic sensor, controlling the catabolic and anabolic processes that are necessary for the ATP/AMP balance ratio to exist. This role belongs to AMPK and it also blends into the field of tumorigenesis, since it is directly inserted into a tumor suppressive signaling network and this makes of it a potential strategy of use for understanding and treating tumors. The present work aimed to produce a transgenic tumor lineage with stable expression of a probe that is able to respond to the activity of AMPK, detectable by FRET, from the development of a transponsable vector. This vector was built from a molecular subcloning that joined the probe insert to the chromosomal insertion machinery backbone of the piggyBac system. The result of this production provides a new alternative for the analysis of the relation of the role of AMPK within tumoral survival, since it can be done in the long term, due its stable expression, and at the single cell level.