Transplante mitocondrial melhora as respostas locomotoras e bioenergéticas medulares após concussões repetidas

Abstract

Concussões repetidas (CR) levam ao desenvolvimento da encefalopatia traumática crônica (ETC), cujos mecanismos envolvem alterações proteicas e mitocondriais. Frequentemente os atletas que sofrem CR apresentam, além de sintomas neuropsicológicos, uma diminuição da capacidade motora, problemas de equilíbrio, perda de coordenação e de força nos membros, o que sugere uma possível expansão do dano primário no cérebro para a medula espinhal. Entretanto, investigações sobre os potenciais mecanismos ainda são limitadas. O objetivo deste trabalho foi investigar se CR propagam alterações bioenergéticas mitocondriais do cérebro para a medula espinhal, e dessa maneira, propor uma terapia inovadora com base no transplante de mitocôndrias. Camundongos CF1, machos de 90 dias de idade foram submetidos à 3 concussões (1 cada 72 h). Os parâmetros biomecânicos foram: profundidade: 5 mm, velocidade, 5,7 m/s; e tempo de permanência no local, 0,1s. Após 24 h os animais receberam uma injeção intratecal de 5 uL de salina ou mitocôndrias isoladas de córtex cerebral, originando os grupos: controle (CT), transplante de mitocôndria (MIT), CR e CR-MIT, (n=12 por grupo). Vinte-quatro horas após o transplante mitocondrial os animais foram submetidos a testes motores como campo aberto (CA), teste do cilindro (TC), beam walk (BW); e de força dos membros superiores (grip strenght, GS). O imunoconteúdo dos marcadores de neurodegeneração (pTAUser396/TAU, clivagem de α-espectrina e clivagem de Caspase 3) e proteínas mitocondriais (TOM20 e PGC1α) foram dosadas em homogeneizados de córtex, hipocampo, hipotálamo, terço proximal e terço distal da medula. Em mitocôndrias isoladas dos terços medulares foi realizado um painel de ensaios mitocondriais. Os animais submetidos a CR apresentaram uma diminuição coordenação de movimentos simétricos, equilíbrio e força nos membros superiores (TC, BW e GS) o que foi revertido pelo transplante intratecal de mitocôndrias. Ainda, houveram prejuízos mitocondriais na eficiência do sistema de transporte de elétrons (STE) respirometria acoplada a síntese de ATP, nas dinâmicas do potencial de membrana e no efluxo de Ca2+ tanto nas porções proximais e caudais da medula. Estas alterações foram revertidas na região caudal e atenuadas na porção proximal após o transplante de mitocôndrias. A produção de H2O2 mitocondrial foi elevada no grupo CR porem revertida a níveis do controle no grupo CR-MIT, no grupo MIT houve uma diminuição da produção de peróxido de hidrogênio quando comparado com CT. O aumento de TOM20 e PGC1α indica um aumento do conteúdo mitocondrial nos grupos transplantados. A atividade das desidrogenasses mitocondriais estavam diminuídas nas três regiões cerebrais (CX, HC e HT) e no terço proximal da medula, esse prejuízo foi revertido na medula pelo transplante mitocondrial. Encontramos um aumento nos biomarcadores de neurodegeneração (pTAUser396/TAU, clivagem de α-espectrina e clivagem de Caspase 3) no cérebro (CX, HC e HT) e nas duas porções medulares, na medula o tratamento foi capaz de reverter essa condição. Dessa forma CR propagam alterações bioenergéticas mitocondriais ao longo de toda a extensão da medula espinhal o que representa um mecanismo patofisiológico associado aos prejuízos neurológicos. O transplante mitocondrial, melhorou o perfil bioenergético e reverteu os prejuízos neurológicos sugerindo uma integração das mitocôndrias na medula espinhal. Estes resultados colocam a atividade bionergética mitocondrial como um componente central envolvido na recuperação motora após CR.

Repeated concussion (RC) is strongly associated with chronic traumatic encephalopathy. In this condition, a classical find is the diffuse axonal degeneration, which is characterized by proteins aggregation, mitochondrial dysfunction, and neurodegeneration. Frequently, former athletes who suffered from RC presents, besides the neuropsychological symptoms, decreased motor capacity, balance problems, loss of coordination and strength in the limbs, suggesting a possible expansion of primary brain damage to the spinal cord. However, this issue has been poorly explored related to the interplay between RC and spinal cord degeneration. In this study we aimed to investigate whether the CR propagated mitochondrial bioenergetic changes and axonal degeneration from the brain to the spinal cord, and thus propose an innovative mitochondrial transplant-based therapy. CF1 male mice, 90-days years old were subjected to 3 concussions (with 72h interval between each one). Biomechanical parameters for the cortical impact (CCI) were: depth: 5 mm, velocity, 5.7 m /sec; and length of stay on site, 0.1sec. After 24 hours, the animals received an intrathecal injection of 5 μL of saline or mitochondria isolated from the cerebral cortex, resulting in groups: control (CT), mitochondrial transplantation (MIT), repeated concussion (RC) and RC-MIT, (n = 12 animals per group). Twenty-four hours after mitochondrial transplantation the animals underwent motor tests such as open field (OF), cylinder test, beam walk (BW); and upper limb strength (grip strength, GS). Biochemical analyzes of mitochondrial activity and protein biomarkers were performed on mitochondria isolated from the proximal and caudal portions of the spinal cord, and in homogenates from the cortex (CX), hippocampus (HC) and hypothalamus (HT). The animals submitted to CR presented a decreased strength in the upper limbs symmetric coordination and balance (GS, cylinder test and BW) which was reversed by the intrathecal mitochondrial transplantation. Furthermore, there were impairments in the mitochondrial Ca2+ efflux mediated for NCLX, membrane potential dynamics, electron Transport system (ETS) efficiency and ATP synthesis-coupled respirometry, in both the proximal and caudal portions of the medulla. These abnormalities were reversed in the caudal region and attenuated in the proximal portion after mitochondrial transplantation. The rise in mitochondrial H2O2 production in the RC group was reversed to control levels in the MIT-RC group and decreased in the MIT when compared to the CT group. The increase in TOM20 and PGC1α indicates an increase in mitochondrial content in the transplanted groups. Mitochondrial dehydrogenase activity was decreased in the brain regions (CX, HC, HT), and in the proximal spinal cord. All deficits were restored after the mitochondrial transplantation. Neurodegeneration biomarkers (pTAUser396/TAU, cleaved α-spectrin and cleaved Caspase-3) were increased in all three brain regions and in both portions of the medulla. Mitochondrial transplantation was able to reverse these alterations in the spinal cord of the RC-MIT group relative to CT. Repeated concussions propagate neurodegenerative signaling likely through mitochondrial bioenergetic alterations from the brain to along the entire length of the spinal cord. This may represent a pathophysiological mechanism associated with neurological damage. Mitochondrial transplantation improved the bioenergetic profile and reversed neurological impairments suggesting an integration of mitochondria in the spinal cord. These results place mitochondrial bioenergetics activity as a pivotal component involved in motor recovery after CR.