Análise da formação e desenvolvimento de biofilmes em blocos de dentina humana

Abstract

Micro-organismos e seus produtos são os principais agentes causadores de 3 patologias pulpares e periapicais. Esses micro-organismos podem estar dispostos 4 em biofilmes em infecções primárias ou secundárias do canal radicular. Por isso, é 5 de extrema importância para a endodontia estudar esses biofilmes. No entanto, 6 ainda há muita controvérsia na literatura sobre a metodologia de cultivo e incubação. 7 Portanto, o objetivo desse estudo é caracterizar biofilmes formados in situ seguido 8 de diferentes métodos de incubação e meio de cultura. Com isso, o objetivo é 9 também avaliar a influência do meio de cultura e do tempo de incubação na 10 formação de biofilmes in situ e desenvolvimento in vitro. Para esse estudo, foram 11 selecionados 5 voluntários de acordo com critérios de inclusão. A metodologia foi 12 separada em 2 fases e os mesmos 5 voluntários participaram de ambas. Uma placa 13 intra-oral foi confeccionada para cada voluntário. Em cada uma, foram fixados 4 14 blocos de dentina humana (2x2x2mm). Os voluntários utilizaram a placa durante 3 15 dias e então uma amostra de cada placa foi separada para a extração de DNA e 16 hibridização DNA-DNA (Checkerboard DNA-DNA Hybridization). As outras 3 17 amostras de cada voluntário foram incubadas em meio de cultura BHI e estufa 18 microbiológica (37º C). No período de 7, 14 e 21 dias, uma amostra de cada 19 voluntário era removida para extração de DNA e análise de hibridização. Outra 20 amostra foi avaliada quanto ao biovolume de biofilme e quanto a viabilidade das 21 células bacterianas, por meio de microscopia confocal a laser. Após a primeira fase, 22 houve um período de intervalo (wash-out) de 7 dias até a segunda fase. A mesma 23 metodologia foi realizada com diferença para as condições de incubação que, dessa 24 vez, foi meio de cultura FAB em jarra de anaerobiose. Os dados foram tabulados e 25 procedeu-se a análise estatística. Os resultados mostraram que houve maior 26 diversidade e quantidade de espécies para o meio FAB em jarra de anaerobiose em 27 comparação ao BHI. A análise imediata mostrou uma maior diversidade de espécies 28 e também maior carga microbiana tanto para o BHI quanto para o FAB. Análises de 29 agrupamento de Ward demostraram que amostras pertencentes ao mesmo 30 participante, mas em diferentes tipos de incubação, não são similares. As amostras 31 de um mesmo período de tempo, mas provenientes de diferentes voluntários 32 também não são similares. As amostras de BHI, de um modo geral, são mais 33 similares entre si do que as do FAB. O biofilme de FAB em 14 dias tem carga 34 microbiana significantemente maior que o período imediato e 7 dias nas mesmas 35 condições, e também foi significantemente maior que o mesmo período em BHI. A 36 carga microbiana das espécies selecionadas em BHI decresce ao longo do tempo, 37 no entanto, o biovolume permanece estatisticamente estável. É possível que haja 38 um crescimento de micro-organismos anaeróbios facultativos, os quais não tem uma 39 significante representatividade nas sondas de DNA selecionadas para esse estudo. 40 Pode-se concluir que há particularidades nos biofilmes formados mesmo em 41 mesmas condições de incubação ou de amostras provenientes de um mesmo 42 paciente. Além disso, não há uma metodologia ideal para a formação de biofilmes 43 pois depende do objetivo de cada estudo o qual definirá o tipo de biofilme que se 44 espera e, com isso, também sua metodologia

Microorganisms can be disposed in biofilms and cause primary or secondary 3 infections in the root canal system and periapical tissues. Therefore, studying these 4 biofilms is extremely important in Endodontics. However, the current literature 5 presents many controversies with regard to the methodology of biofilm cultivation and 6 incubation. Then, the aim of this study is to characterize the biofilm which is formed in 7 situ followed by different incubation and culture media conditions. Additionally, the 8 aim is also to evaluate the influence of the culture media and incubation period in the 9 in situ biofilm formation and in vitro development. Five volunteers were selected to 10 this study according to the inclusion criteria. The methodology was divided in 2 11 different stages, and same volunteers participated in both. An intraoral apparatus 12 was made for each individual. Four human dentine blocks (2x2x2mm) were attached 13 to each apparatus. Volunteers used these apparatuses for 3 days and then one 14 sample of each was separated for DNA extraction and Checkerboard Hybridization. 15 Those 3 left dentine blocks of each volunteer were incubated in BHI culture media in 16 microbiological incubator (37ºC). In 7, 14 and 21 days, one sample of each volunteer 17 was removed for DNA extraction and Checkerboard analysis. The sample was 18 evaluated for biofilm biovolume and percentage of viable cells, through confocal 19 microscopy. After this first stage, there was a washout period of 7 days until the next 20 stage. Same methodology was performed in the second stage, apart from the 21 incubation conditions which were in FAB culture media and anaeThe sample was 18 evaluated for biofilm biovolume and percentage of viable cells, through confocal 19 microscopy. After this first stage, there was a washout period of 7 days until the next 20 stage. Same methodology was performed in the second stage, apart from the 21 incubation conditions which were in FAB culture media and anaerobiosis jar. Data 22 were collected and statistical analysis was carried out. The results showed that there 23 were greater species diversity and higher microbial loads for FAB and anaerobiosis 24 jar in comparison with BHI. Immediate analysis showed greater diversity and higher 25 loads for both BHI and FAB in comparison with the other time periods. Ward’s 26 grouping analysis showed that even those samples which belonged from the same 27 patient were not similar to each other when they are incubated in different conditions. 28 Samples from same time period which belong to different patients were not similar to 29 each other as well. BHI incubated samples are more similar among them in 30 comparison with the FAB ones. The biofilms which were incubated in FAB for 14 31 days are statistically higher in bacterial load than immediate and 7 days in same 32 incubation conditions. Furthermore, samples of FAB in 14 days were statistically 33 higher in bacterial load when comparing to the same time period in BHI. Microbial 34 loads of the selected species seem to decrease over time in BHI conditions whereas 35 the biovolume remained statistically stable. This situation might be associated with 36 the growth of facultative anaerobe species, which did not have a significant 37 representativeness in the selected species for this study. In conclusion, every biofilm, 38 even when they originally belong from the same patient or incubated in same 39 conditions, is unique. Furthermore, there is no ideal methodology for biofilm 40 formation and development since it depends on the aim of each study which define 41 the one which adapts the most according to the type of biofilm that is going to be 42 formed.