Suscetibilidade e adaptações metabólicas do agente da cromoblastomicose Fonsecaea pedrosoi frente ao itraconazol e ao triciclazol utilizando FTIR e quimiometria

Abstract

Introdução: a cromoblastomicose (CBM) é uma micose subcutânea cujo principal agente etiológico no Brasil é o fungo filamentoso dematiáceo Fonsecaea pedrosoi, que produz melanina dihidroxinaftaleno (DHN). O itraconazol (ITC) é um dos antifúngicos mais utilizados no tratamento, entretanto sua eficácia é variável. Dessa forma, é muito importante a realização de ensaios de suscetibilidade in vitro. Para fungos filamentosos, esses ensaios são realizados seguindo o protocolo M38 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), que não é voltado para utilização rotineira. Uma tecnologia inovadora para determinação da suscetibilidade a antifúngicos é a espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) associada à quimiometria. Porém, não há nenhum estudo na literatura que avalia sua aplicação em ensaios de suscetibilidade para fungos filamentosos. FTIR também pode ser utilizada para estudo das adaptações metabólicas da espécie F. pedrosoi quando exposta ao ITC e ao triciclazol (TCZ), um inibidor da biossíntese da melanina-DHN. Objetivo: Propor um modelo de predição das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) do ITC para isolados de F. pedrosoi e suas respectivas adaptações metabólicas, com adição de TCZ, utilizando FTIR e análises quimiométricas. Métodos: Foram estudados 36 isolados genotipados de F. pedrosoi. A suscetibilidade ao ITC foi determinada de acordo com o protocolo M38-A2 do CLSI e com a adição de TCZ. Os isolados foram cultivados em placas somente com ágar Sabouraud e com a adição de ITC e TCZ e então preparados para a análise de Reflexão Total Atenuada (FTIR-ATR). Cinco espectros foram adquiridos na faixa de 4000 a 650 cm-1 para cada isolado. O conjunto de dados foi pré-processado por amostra por normalização pela amplitude e 1ª derivada. O algoritmo de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) foi realizado com as quintuplicatas usando uma componente de correção ortogonal de sinal (OSC) e validação cruzada leave-one-out para os conjuntos de calibração e predição. A Análise de Componentes Principais (PCA) e a Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA) foram realizadas com os espectros médios das diferenças entre os testes e o tratamento padrão de cada isolado após normalização e centragem na média. Resultados: os espectros médios de F. pedrosoi apresentaram pouca variabilidade. Os isolados resistentes se diferenciaram (p<0.05) dos não resistentes na região 1038 cm-1 (estruturas da parede celular). Um coeficiente de determinação (R2) maior que 0.99 foi obtido tanto para CIM ITC quanto para CIM ITC+TCZ no modelo FTIR-ATR/PLS. Para o modelo CIM ITC, a Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da Previsão (RMSEP) foi de 0,0645 μg/mL e o erro relativo foi de 51,6% (faixa de CIMs variando entre 0,125 e 32 μg/mL); e para CIM ITC+TCZ esses valores foram de 0,0063 μg/mL e 10,5%, respectivamente (faixa de CIMs variando entre 0,06 e 2 μg/mL). A PCA e a HCA mostraram agrupamentos de isolados resistentes e a existência de ao menos três morfotipos espectrais de F. pedrosoi de acordo com os tratamentos ITC/TCZ. Conclusão: este foi o primeiro estudo a propor o uso de FTIR-ATR e análises quimiométricas supervisionado pelo protocolo M38-A2 para prever as CIMs de itraconazol para o fungo filamentoso F. pedrosoi. O novo método tem alta qualidade preditiva para uma faixa ampla de valores de CIMs. Estudos posteriores são necessários para interpretar as repercussões clínicas das adaptações metabólicas de F. pedrosoi com uso de ITC e TCZ.

Background: chromoblastomycosis (CBM) is a subcutaneous mycosis whose main etiological agent in Brazil is the filamentous fungus Fonsecaea pedrosoi. Itraconazole (ITC) is one of the most used antifungals in treatment, however its efficacy is very variable. Thus, it is very important to perform in vitro susceptibility tests. For filamentous fungi, these tests are performed according to M38 protocol of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), which is not aimed for routine use. An innovative technology for determining antifungal susceptibility is Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) combined with chemometrics. However, there isn’t any study in literature that assesses its application in susceptibility tests for filamentous fungi. FTIR can also be used to study the metabolic adaptations of F. pedrosoi when exposed to ITC and to tricyclazole (TCZ), an DHN-melanin biosynthesis inhibitor. Objective: to propose a model of ITC minimum inhibitory concentrations (MICs) prediction for F. pedrosoi isolates and its respective metabolic adaptations, with addition of TCZ, using FTIR and chemometric analyses. Methods: Thirty-six genotyped isolates of F. pedrosoi were studied. Susceptibility to ITC was determined according to M38-A2 protocol of CLSI and with addition of tricyclazole (TCZ). The isolates were grown in plates with Sabouraud agar alone and with addition of ITC and TCZ and then prepared for Attenuated Total Reflection (FTIR-ATR) analysis. Five spectra were recorded from 4000 to 650 cm-1 for each isolate. Data set was sample pre-processed by amplitude normalization and 1st derivative. Partial least squares regression (PLS) algorithm was performed with quintuplicates using one component of orthogonal signal correction (OSC) and leave-one-out step-validation for calibration and prediction set. Principal Component Analysis (PCA) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA) were carried out with the average spectra of the difference between the tests and the control of each isolate after normalization and mean centering. Results: the average spectra of F. pedrosoi isolates presented little variability. Resistant isolates were differentiated (p<0.05) of the non-resistant by the region 1038 cm-1 (structures of the cell wall). A coefficient of determination (R²) greater than 0.99 was obtained for both MIC ITC and MIC ITC+TCZ in FTIR-ATR/PLS model. For MIC ITC model, the Root Mean Square Error of Prediction (RMSEP) was 0,0645 μg/mL and the relative error was 51,6% (MIC values ranging from 0,125 to 32 μg/mL); and for MIC ITC+TCZ model this values were 0,0063 μg/mL and 10,5%, respectively (MIC values ranging from 0,06 to 2 μg/mL). PCA and HCA showed clusters of resistant isolates and until three spectral morphotypes pattern of F. pedrosoi second the treatment with ITC/TCZ. Conclusion: this was the first study to propose the use of FTIR-ATR and chemometric analyses supervised by the M38-A2 protocol for predicting itraconazole MICs of the filamentous fungus F. pedrosoi. The new method has high predictive quality for a wide range of MIC values. Further studies are needed to interpret the clinical repercussions of F. pedrosoi metabolic adaptations using ITC and TCZ.