RT-PCR for detection on bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3)

Abstract

A técnica de RT-PCR tem sido freqüentemente utilizada para a detecção do vírus parainfluenza humano tipo 3 (hPIV- 3), mas a literatura é escassa em relação ao vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3) .O objetivo deste trabalho foi descrever uma técnica de reação em cadeia pela polimerase, precedida de transcrição reversa (RT-PCR), para a detecção do vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3), usando oligonucleotídeos degenerados para uma região conservada do gene da hemaglutininaneuraminidase (HN). A amostra-referência SF-4 e três diferentes isolados brasileiros de bPIV-3, além de cinco amostras virais de diferentes origens, foram incluídos neste estudo. Os vírus foram cultivados em células MDBK sob condições padronizadas. O teste de hemaglutinação (HA) foi utilizado para a titulação viral, e o teste de imunofluorescência direta (DFTA) para a triagem dos isolados. Na RT-PCR, todos os isolados de bPIV-3 mostraram amplificação de um fragmento esperado de 1009 pb do gene HN, ao contrário do que aconteceu com as amostras virais não bPIV-3, onde não foi detectada amplificação. Empregando a amostra SF-4 como controle positivo, foi obtida uma sensibilidade de 95 pg de cDNA. Apesar do pequeno número de amostras de bPIV- 3 testadas, os resultados obtidos neste estudo apontam para o uso potencial desta técnica na detecção de bPIV-3 em amostras clínicas bovinas.

The RT-PCR technique has been frequentely used for detection of the human parainfluenza virus type 3 (hPIV-3) but the literature is scarce in relation to the bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3). The aim of this study was to describe a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection of bovine parainfluenza virus type 3 (bPIV-3) using degenerate oligonucleotides targeting a conserved region of hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Reference strain SF-4 and three different brazilian bPIV-3 isolates, besides five viral strains from different sources, were included in this study. Viruses were cultured in MDBK cells under standard conditions. Hemagglutination (HA) test was used for viral titration and a direct immunofluorescence test (DFAT) for isolate screening. In RT-PCR all bPIV-3 isolates showed amplification of an expected 1009 bp fragment of HN gene, as oposed to non PIV-3 viral samples where no amplification was detected. Using SF-4 as positive control, sensitivity of 95 pg cDNA wasachieved. In spite of the low number of bPIV-3 isolates tested, the results obtained in this study point out the potential use of this technique for detection of bPIV-3 in bovine clinical specimens.