Avaliação de citocinas inflamatórias intestinais, hepáticas e de constituintes da barreira intestinal em zebrafish

Abstract

INTRODUÇÃO: A obesidade pode ser caracterizada pelo acúmulo do tecido adiposo e o aumento da massa de gordura gerando um estado pró-inflamatório. Alguns mecanismos têm sido associados às adipocinas e ao aumento da permeabilidade intestinal. A utilização do zebrafish como modelo de obesidade tem se apresentado promissor para compreensão das causas metabólicas da obesidade e de suas doenças associadas. OBJETIVO: Avaliar a expressão gênica de citocinas inflamatórias intestinais e hepáticas e de moléculas constituintes de barreira intestinal e em um modelo de obesidade induzido por dieta hipercalórica em zebrafish. MATERIAIS E MÉTODOS: O estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa definiu-se a dieta para estabelecer a obesidade e avaliar presença de esteatose hepática. Avaliamos peso, índice de massa corporal (IMC) e presença de acúmulo de gordura no fígado por Oil Red O. O acúmulo de gordura foi quantificado por ImageJ e Nile Red. Na segunda etapa avaliamos níveis séricos do perfil lipídico, glicemia e expressão gênica de citocinas inflamatórias intestinal e hepática – il-1β, tnf-α e il-10 - e constituintes das tight junction (TJ) da barreira intestinal - claudina-c (cldn-c), claudina-15a (cldn-15a), claudina-15b (cldn-15b) e molécula de adesão juncional-A (f11r). RESULTADOS: Na primeira etapa 30 peixes foram divididos em três grupos (n=10): grupo controle (GC), grupo obesidade 20% (GO20) e grupo obesidade 30% (GO30), o volume de dieta padrão utilizada no GC foi correspondente a 10% do peso dos peixes; e os grupos GO20 e GO30 receberam o correspondente a 20% e 30% do peso, respectivamente. No final de quatro semanas de dieta hipercalórica (DHC) foram observados aumento de peso e de IMC e presença de esteatose hepática no GO30 quando comparados com os demais grupos. Na segunda etapa 60 peixes foram divididos em dois grupos (n=30): grupo controle (GC), que recebeu dieta correspondente a 10% do peso dos peixes; e o grupo obeso (GO), que recebeu dieta correspondente a 30% do peso dos peixes. Após quatro semanas de dieta os animais do GO obtiveram aumento do nível sérico de triglicerídeos e glicemia quando comparados com o GC. O nível sérico de colesterol total não apresentou diferença entre os grupos. Os constituintes das TJ da barreia intestinal cldn-c e f11r apresentaram menor expressão gênica no GO. Contudo cldn-15a e cldn-15b não apresentaram diferença entre os grupos na sua expressão. Houve aumento na expressão gênica das citocinas intestinais il-1β, tnf-α e il-10 nos animais GO. Em relação às citocinas inflamatórias hepáticas houve aumento na expressão gênica de il-1β enquanto a expressão gênica de il-10 apresentou diminuição no GO em comparação com o grupo GC. Não houve diferença na expressão gênica intestinal de tnf-α entre os grupos. CONCLUSÃO: Nos animais submetidos à DHC houve aumento dos níveis séricos de triglicerídeos e de glicemia, e maior acúmulo de gordura no fígado. Também houve aumento na expressão gênica de citocinas inflamatórias intestinais e houve aumento na expressão da citocina inflamatória hepáticas il-1β e diminuição de il-10. Houve diminuição na expressão de componentes das TJ cldn-c e f11r em zebrafish obesos. Esta última alteração pode levar ao aumento na permeabilidade intestinal.

INTRODUCTION: Obesity can be characterized by the accumulation of adipose tissue and the increase of fat mass generating a pro-inflammatory state. Some mechanisms of this state have been associated with adipokines and increased intestinal permeability. The use zebrafish as obesity model has shown promise for understanding the metabolic causes of obesity and its associated diseases. MATERIALS AND METHODS: The study was divided into two steps. In the first step, the volume of diet to establish obesity in the animals was defined. We evaluated weight, body mass index (BMI) and presence of fat accumulation in the liver of the animals by histological staining with Oil Red O. And its quantification by ImageJ and Nile Red. In the second step, we evaluated serum lipid levels, glycaemia and gene expression of hepatic and intestinal inflammatory cytokines – il-1ß, il-10 and tnf-α- and molecules constituents of tight junction (TJ) - claudin-c (cldn-c), claudin-15a (cldn-15a), claudin-15b (cldn-15b) e junctional adhesion molecules-A (f11r). RESULTS: Thirty fish were divided in three groups (n = 10): control group (CG), 20% obesity group (OG20) and 30% obesity group (OG30). In CG, the standard diet volume corresponds to 10% of fish weight; and the OG20 and OG30 groups received 20% and 30% weight diet, respectively. At the end of four weeks of hypercaloric diet (HCD) we observed weight gain, BMI increase and the presence of hepatic steatosis in GO30 when compared with the other groups. The second step was performed using 60 fish, which were divided into two groups (n = 30): control group (CG) and obese group (OG). After four weeks of diet, OG animals had increased serum triglycerides and glycaemia. When compared with the CG, serum levels of total cholesterol did not show any difference. The molecules constituents of TJ, cldn-c and the f11r had lower gene expression in the OG. However, cldn-15a and cldn-15b showed no difference in expression when the OG and CG groups were compared. There was an increase in the gene expression of the intestinal cytokines il-1β, tnf-α and il-10 in OG animals. In relation to hepatic inflammatory cytokines in OG, an increase in the il-1β gene expression was observed while the il-10 gene expression decreased. There was no difference in tnf-α between the groups. CONCLUSION: In obese animals submitted to hypercaloric diet there was an increase in triglyceride serum levels and glycaemia; besides fat accumulation in the liver. There was also alteration in gene expression of intestinal and hepatic inflammatory cytokines and components of the TJ of the intestinal epithelial barrier in obese zebrafish. This last alteration may lead to increased intestinal permeability.