Efeito do tratamento com extrato de Fasciola hepatica e cistatinas recombinantes de Fasciola hepatica em modelo de artrite induzida por antígeno

Abstract

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica com subsequente destruição articular devido à inflamação crônica sinovial, o que leva a dor e incapacidade funcional. Apesar dos recentes progressos no tratamento da AR, ainda há limitações na eficácia e efeitos adversos importantes, ressaltando a necessidade de encontrar novas estratégias terapêuticas que diminuam esses efeitos adversos e retardem a evolução da doença. A Fasciola hepatica é um verme do Filo Platyhelminthes e quando presente em um organismo hospedeiro apresenta produtos secretores- excretores (ESPs) e antígenos de tegumento, os quais podem atuar como moduladores da resposta imune e inflamatória. Dentre esses produtos estão as cistatinas, moléculas inibidoras de cisteíno-protease. Estudos prévios com cistatinas provenientes de Schistosoma japonicum, mostraram o potencial terapêutico em modelos animais de colite e artrite. Dentro desse contexto, esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito das cistatinas recombinantes 1 e 3 e do extrato de Fasciola hepatica sobre parâmetros de inflamação e nocicepção em modelo agudo de artrite induzida por antígeno (AIA). Camundongos Balb/c foram imunizados através de injeção subcutânea de 200 μL de uma emulsão contendo adjuvante de Freund e albumina bovina sérica metilada (mBSA) no dia 0. O reforço foi feito nos dias 7 e 14 utilizando o adjuvante incompleto de Freund. No 21° dia, os camundongos receberam uma injeção intra-articular de mBSA no joelho direito. Os animais foram divididos em grupos: veículo (tratado com PBS), extrato de Fasciola hepatica (200 μg), cistatina 1 (100μg e 150 μg), cistatina 3 (100μg e 150 μg), e receberam tratamento via intraperitoneal 24 horas e 30 minutos antes da injeção intra-articular. Houve avaliação de nocicepção utilizando um analgesimetro digital 0, 3h, 6h e 24h após a injeção intra-articular. Após 24 horas da injeção, os animais foram eutanasiados e foi realizado lavado articular para avaliação da migração celular através da contagem de leucócitos totais por câmara de Neubauer. Os dados foram analisados com o programa GraphPad Prism 6.0 através de ANOVA seguida de testes post-hoc entre os grupos. A significância estatística foi considerada quando p<0,05. O tratamento com 200 μg de extrato de F. hepatica reduziu 44% da migração de leucócitos para o joelho inflamado em comparação com o grupo veículo e foi capaz de reduzir a nocicepção celular nos tempos 3h, 6h e 24h após a injeção de mBSA (p<0,05). Já no tratamento com a cistatina recombinante, 100 μg de ambas cistatinas 1 e 3 reduziu a migração de leucócitos para o joelho inflamado em 40% (p<0,05) e 37% (p<0,001), respectivamente; porém não foi capaz de reduzir a nocicepção celular. O tratamento com a dose mais alta de ambas cistatinas (150 μ g) não foi capaz de alterar os parâmetros avaliados. Portanto, esses resultados destacam o potencial anti-inflamatório e analgésico do extrato, bem como o potencial anti-inflamatório das cistatinas recombinantes em modelo de AIA. Como perspectivas, está a avaliação do tratamento em modelo crônico de artrite, bem como o estudo do mecanismo de ação, focando em células importantes na patofisiologia da artrite reumatoide, como linfócitos e fibroblastos sinoviais.

Rheumatoid Arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease characterized by joint destruction due to synovial chronic inflammation which leads to pain and functional disability. Despite the recent progress in RA treatment, there are still limitations in efficacy and several adverse effects, emphasizing the need to search for novel strategies to decrease adverse effects and better control disease activity. Fasciola hepatica is a Trematode worm that presents excretion/secretion products (ESs) when infect its hosts. Besides, this parasite also have tegument antigens that, together with ESs, can act as immunomodulatory. Among these products are the cystatins, protease inhibitor molecules that have demonstrated some therapeutic potential in animal models of colitis and arthritis. In this context, this study aims to analyze the effects of recombinant cystatins and the extract of F. hepatica over inflammatory and antinociceptive parameters in an acute antigen-induced arthritis mice model. Balb/c mice were immunized through subcutaneous injection of an emulsion containing complete Freund’s adjuvant plus methylated bovine serum albumin (mBSA) at day 0. Boosters injection were performed at day 7 and 14 using incomplete Freund’s adjuvant. At day 21, mice received an intra-articular (ia) injection of mBSA in the right knee. Mice were divided into the following groups: vehicle, F. hepatica extract, cystatin 1 and cystatin 3 and received treatment via intraperitoneal 24h after ia injection and 30 minutes before ia injection. Nociception was measured 0h, 3h, 6h and 24h after ia injection of mBSA using a digital analgesimeter. 24h after ia, animals were euthanasiated and leukocyte migration to the knee was measured by counting the total number of leukocytes using a Neubauer chamber. Data was analyzed using GraphPad Prism 6.0 with ANOVA analysis followed by post-hoc test and results were considered significant when p<0.05. F. hepatica treatment reduced 44% of leukocyte migration when compared to vehicle group (p<0.01) and was able to reduce nociception (p<0.05) in mice subjected to AIA model 3h and 24h after ia injection. Cystatins 1 and 3 in 100μg dose were able to reduce leukocyte migration in 40% (p<0.05) and 37% (p<0.01), respectively. On the other hand, cystatins did not show significant effect in nociception. Therefore, our data indicate an anti-inflammatory and analgesic effect of the extract, and an anti-inflammatory effect of recombinant cystatins of F. hepatica in an acute arthritis model. As a perspective, we aim to study these treatments in a chronic model of arthritis, elucidating the mechanism of action, and to study the effect in key cells of the pathophysiology, as lymphocytes and synovial fibroblasts.