Variações fenotípicas do carcinoma espinocelular oral : efeito das características físicas da matriz extracelular

Abstract

O carcinoma espinocelular oral (CEC) apresenta variabilidade inter e intratumoral. A doença é formada pelas células tumorais e pelos diversos fatores biológicos, químicos e físicos que compõem o microambiente tumoral com poder de influenciar a progressão tumoral. Neste trabalho, avaliamos as modificações fenotípicas intrínsecas do CEC e a influência de fatores físicos (rigidez) nestas células. Em uma revisão de literatura, foi observado que GAPDH e β-actina são os principais genes de referência utilizados em pesquisas de expressão gênica com CEC. Entretanto, demonstramos experimentalmente a grande variabilidade de 5 genes de referência durante análise comparativa de mais de um subtipo celular de tumor, sendo recomendado o uso de 2 ou mais genes de referência para este tipo de ensaio. Devido à esta variabilidade de expressão gênica, utilizamos a ferramenta transcriptograma em dados de sequenciamento de RNA de amostras de diferentes regiões de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. Foi constatada que existem diferenças no perfil de expressão gênica entre as diferentes regiões tumorais, mas também entre os tecidos sadios. Esta diferença pode estar associada às diferentes etiopatogenias do câncer de cabeça e pescoço, bem como às diferentes características bioquímicas e biomecânicas a que estão expostos os tecidos desta região. Visto que clinicamente é observado o endurecimento das bordas das lesões de CEC e que observamos que o aumento da organização das fibras colágenas (maior rigidez) está relacionado com pior prognóstico, analisamos a influência da rigidez da matriz extracelular no fenótipo destas células tumorais. Foram utilizadas linhagens de CEC com baixa (InvL/E:NH) e alta (InvH/E:NL) agressividade expostas a diferentes durezas (0,48 ou 20kPa). Após 24h, observamos que apenas as células InvH/E:NL migraram em maior velocidade em ambiente com alta rigidez (20kPa) quando comparado com baixa rigidez (0,48kPa) (p<0,01). Para avaliar o condicionamento mecânico induzido pelo substrato, as células InvL/E:NH foram cultivadas por 5 dias em ambientes com baixa ou alta rigidez e então trocadas de ambiente para avaliar modificações fenotípicas. Observamos que o condicionamento em ambiente rígido tornou as células InvL/E:NH mais agressivas (~2x de aumento na expressão de N-caderina e da velocidade de migração (p≤0,05)), sendo este efeito mediado pelas adesões das células ao substrato (p<0,01). Estes dados indicam que a própria resposta fibrosa para contenção do tumor pode modular o comportamento invasivo do CEC, contribuindo tanto para a metástase quanto para a recorrência do tumor. Em virtude dos efeitos das características físicas no comportamento celular, realizamos revisão da literatura em que observamos a diversidade de biomateriais e de estratégias in vitro e in vivo para reproduzir de maneira fidedigna o microambiente dos tecidos e dos tumores. Nesta tese, demonstramos que existe uma grande heterogeneidade relacionada ao tipo celular do tumor, ao seu local de origem, à resposta celular frente as características físicas do microambiente e às maneiras de reproduzir os aspectos mecânicos in vitro/in vivo, o que realça a necessidade de uma visão holística do processo de tumorigênese para definir novas estratégias de diagnóstico, prognóstico e tratamento de pacientes com CEC.

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) has inter and intratumoral variability. The disease is constituted by tumor cells and by the tumor microenvironment different biological, chemical and physical factors, which, altogether, influences tumor progression. In the present work, we evaluated intrinsic phenotype alterations of OSCC and the influence of physical factors (stiffness) in these cells. In a literature review, it was observed that GAPDH and β-actin are the mostly used reference genes in OSCC gene expression studies. However, we demonstrated experimentally, in a comparative analysis of 5 reference genes with more than one tumor cell subtype, that there is an important variability among reference genes and, therefore, it is recommended to use at least 2 reference genes in this experimental setup. Due to the gene expression variability observed, we used the transcriptogram tool in order to analyze RNA sequencing data in different regions of head and neck squamous cell carcinoma. It was observed that there are different gene expression profiles among tumor regions, but also among healthy tissue. This difference might be associated with the different etiopathogenic factors of head and neck squamous cell carcinoma, as well as the different biochemical and biomechanical characteristics present in each tissue region. Since it is clinically observed that CEC lesions have indurated borders and that we observed that increased collagen fibber organization (increased stiffness) is related to a poor prognosis, we analyzed the influence of matrix stiffness on tumor cells phenotype. OSCC cell lines with low (InvL/E:NH) and high (InvH/E:NL) aggressiveness profile that were exposed to different stiffness substrates (0.48 or 20kPa) were used. After 24h, we observed that only InvH/E:NL migrated with a higher velocity in a stiff substrate (20kPa) when compared to a soft niche (0.48kPa) (p<0,01). In order to evaluate mechanical conditioning induced by substrate stiffness, InvL/E:NH cells were cultivated for 5 days in a soft or stiff substrates and then re-plated to different stiffness niches to evaluate phenotype alterations. We observed that stiff niche conditioned InvL/E:NH cells into a more aggressive profile (~2 fold increase in N-cadherin expression and migration velocity (p≤0,05)) and these effects were modulated by cell adhesion to the substrate (p<0,01). These data indicate that the fibrous response in order to restrain tumor growth can modulate invasive OSCC behavior, contributing to metastasis and tumor recurrence. Since physical characteristics can influence cell behavior, we performed a literature review and observed that there are a diversity of biomaterials and in vitro and in vivo strategies that can reproduce tissue and tumor microenvironment. In the present thesis, we demonstrated that there is a high heterogeneity among tumor cell types, tumor location, cell response to microenvironment physical characteristics and strategies to reproduce in vitro/in vivo mechanical characteristics. This highlights the need of a holistic vision of the tumorigenesis process in order to develop novel strategies for diagnosis, prognosis and treatments for OSCC patients.