Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação simultânea de ácido micofenólico e seu metabolito glicuronídeo por CL/EM em plasma e fluído oral de pacientes transplantados renais

Abstract

Com o envelhecimento da população brasileira, o número de doenças crônicas vem aumentando, entre as quais se destaca a insuficiência renal. O tratamento recomendado é o transplante renal. Uma das principais preocupações do transplante é o alto risco de rejeição, por isso é necessário o uso de imunossupressores que diminuem a atividade do sistema imunológico. Um dos principais fármacos utilizado na terapia de imunossupressão é o micofenolato de mofetila (MMF), um potente inibidor seletivo, não competitivo e reversível da desidrogenase inosina-monofosfato (IMPDH) que atua inibindo a síntese de guanina, provocando uma diminuição da taxa de proliferação. Os imunossupressores estão relacionados a muitos efeitos secundários, sendo necessário um monitoramento terapêutico, a principal matriz utilizada é o plasma. Porém, o uso do fluido oral vem aumentando, por não necessitar de coleta invasiva e pessoal especializado para tal. Um método de cromatografia líquida acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS) foi desenvolvido e validado para a determinação do ácido micofenólico (MPA) e seu metabólito glicuronideo (MPAG), em plasma e fluido oral, com precipitação de proteínas seguido de centrifugação e utilizando cetoprofeno (KET) como padrão interno (PI). Os picos foram separados em condição gradiente, com um tempo de corrida de 16 min, através de uma coluna Agilent Zorbax Eclipse Plus (4.6 x 150 mm, 3.5 μm tamanho de partícula) a 35 °C. Um íon foi utilizado para a quantificação e três íons para a confirmação de cada analito. O método foi linear para todos os analitos no intervalo de concentração de 10,0 – 500,0 ng/mL para o MPA e 30,0 – 500,0 ng/mL para MPAG, com coeficientes de correlação (r) entre 0,9925 – 0,9937 para as amostras de plasma e com r entre 0,9952 – 0,9973 para as amostras de fluido oral. O limite inferior de quantificação foi de 10,0 ng/mL para o MPA e 30,0 ng/mL para o MPAG, com parâmetros de validação dentro do preconizado. O efeito matriz foi avaliado e apresentou resultados adequados, demonstrando que ambos os procedimentos de limpeza das amostras são rápidos e confiáveis, exigindo pequenas quantidades. O método foi aplicado em amostras de pacientes transplantados renais de fluido oral e plasma usando menos pontos que usualmente. Após análise farmacocinética foi encontrado que o fluido oral pode ser uma possível matriz para ser usando no monitoramento terapêutico sendo necessário ainda mais estudos para ser aplicado na clínica. Estudos in vitro para medir e tentar estabelecer uma relação de permeação do MPA dentro do linfócito foram realizados afim de correlacionar com achados nas amostras coletadas de pacientes. Após analisar as amostras dos pacientes foi encontrado que o estudo in vitro utilizando sangue total é que mais se aproxima dos resultados encontrados em amostras reais. Além de MPA dentro do linfócito foi também detectado MPAG, que ainda não havia sido descrito na literatura. A relação da quantidade dos dois metabólitos dentro do linfócito foi menor que 4%.

With the aging of the population, the number of chronic diseases is increasing, standing out kidney disease. The recommended treatment for this disease is renal transplantation, which increases the patient’s quality of life. The major concern with transplantation is the high risk of rejection and that is why it is necessary the use of immunosuppressive drugs to decrease the activity of the immune system. One of the main drugs used in immunosuppressive therapy is mycophenolate mofetil (MMF), a potent noncompetitive and reversible selective inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), which acts inhibiting the synthesis of guanine, producing a decrease in the proliferation rate. Immunosuppressors are related with many side effects, and therapeutic monitoring is required, the main matrix being used is plasma. However, the use of oral fluid is increasing because it does not require invasive collection or specialized personnel to perform it. A liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) method was developed and validated for the determination of mycophenolic acid (MPA) and its glucuronide metabolite (MPAG) in plasma and oral fluid. Samples were analysed after a simple protein precipitation procedure followed by centrifugation using ketoprofen (KET) as internal standard (PI). The peaks were separated under gradient condition, run time of 16 min, using an Agilent Zorbax Eclipse Plus column (4.6 x 150 mm, 3.5 μm particle size) at 35 °C. One ion was used for quantification and three more for confirmation of each analyte. The method was linear for all analytes in the concentration range of 10.0 – 500.0 ng / mL for MPA and 30.0 – 500.0 ng/mL for MPAG, with correlation coefficients (r) between 0.9925 - 0.9937 for plasma samples and 0.9952 - 0.9973 for oral fluid samples. The lower limit of quantification was 10 ng / mL for MPA and 30 ng / mL for MPAG, with validation parameters within the recommended range. Matrix effect was evaluated and showed adequate results, demonstrating that sample cleaning procedure was fast and reliable, requiring small amounts of organic solvent. The method was applied to samples of oral fluid and plasma from renal transplant patients using limited sample collection. After pharmacokinetic analysis, it was found that the oral fluid might be a possible matrix to be used in therapeutic monitoring and further studies are needed to be applied in the clinic. In vitro studies to measure and try to establish a permeation rate of MPA lymphocyte concentration were performed in order to correlate with findings in the samples collected from patients. After analyzing patients samples, it was found that the in vitro study using total blood is the one that more correlates with what was found on real samples. In addition to MPA it was also detected MPAG inside the lymphocytes, which had not yet been described yet. The quantity relation of the two metabolites inside the lymphocyte was less than 4%.