Nanopartículas lipídicas inovadoras contendo fucoxantina : desenvolvimento tecnológico, controle de qualidade e avaliação toxicológica

Abstract

A fucoxantina (FUCO) tem apresentado efeitos promissores no tratamento do câncer, como promotor da apoptose, indutor da interrupção do ciclo celular, supressor de metástases e ação cutânea na melanogênese induzida por raios UVB. As nanopartículas lipídicas (NL) apresentam destaque frente a outros sistemas e novas matérias-primas vêm sendo utilizadas para sua preparação, destacando-se as matérias-primas provenientes da Amazônia brasileira. No entanto, a FUCO é uma molécula instável, o que limita seu uso. Diante do exposto, o presente trabalho visa o desenvolvimento de NL inovadoras contendo uma combinação de manteiga de bacuri e óleo de tucumã para a incorporação da FUCO (NL-FUCO). O Capítulo I apresenta a caracterização por espectrometria de massas e de ressonância magnética nuclear da FUCO matéria-prima, que foi adquirida em duas apresentações, incorporada em um óleo e em pó. As duas matérias-primas da FUCO foram identificadas como total-trans e 9’-cis FUCO, respectivamente. Na etapa seguinte, foi desenvolvido um método analítico indicativo de estabilidade por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para a quantificação e controle de qualidade da FUCO e do seu isômero. Para isto, foi utilizada uma coluna C18, fase móvel isocrática composta por acetonitrila e água pH 7,0 (9,5:0,5 v/v) e detecção em 450 nm. Os resultados demonstraram que o método é linear na faixa de concentração estudada, preciso e exato. A robustez do método foi avaliada por desenho experimental Box-Behnken, demonstrando que as modificações nos fatores estudados não interferiram na quantificação da FUCO. No Capítulo II, as NL inovadoras foram desenvolvidas com o preparo de seis formulações, variando as proporções da manteiga de bacuri e do óleo de tucumã, pelo método homogeneização de alto cisalhamento. Na etapa seguinte, estas formulações foram caracterizadas e os resultados indicaram que o diâmetro médio das NL foram inferiores a 255 nm, com baixo índice de polidispersão (pdI) e potencial zeta entre - 11 mV e -24 mV. A avaliação da morfologia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) demonstrou partículas esféricas, homogêneas e com dimensões nanométricas. No estudo de estabilidade, todas as formulações mantiveram-se estáveis por dois meses à temperatura ambiente, porém a formulação com 5% de manteiga de bacuri e 4% de óleo de tucumã apresentou melhores resultados. No Capítulo III, está descrita a incorporação da FUCO na formulação de NL inovadoras anteriormente selecionada. As NL-FUCO apresentaram diâmetro médio de 243 nm, baixo pdI, alta taxa de encapsulação e teor adequado. O método por CLAE para quantificação da FUCO nas NL demonstrou ser linear, preciso e exato. Na segunda etapa, as NL-FUCO foram incorporadas em um hidrogel e apresentaram pH adequado para aplicação cutânea, mantendo sua dimensão nanométrica, com baixo pdI e teor próximo a 100%. No estudo de fotoestabilidade com luz UVA, as NL protegeram a FUCO. No estudo de estabilidade, as NL-FUCO mostraram-se estáveis durante 45 dias armazenadas em 6 ºC, 25 ºC e 40 ºC. O estudo de dissolução indicou uma liberação sustentada da FUCO a partir das NL, quando comparada à FUCO livre. Através dos estudos de permeação cutânea in vitro, foi possível quantificar a FUCO na epiderme e na derme e comprovou-se a capacidade das NL em modificar a permeação da FUCO. Quando o estrato córneo foi removido, as concentrações da FUCO aumentaram na epiderme e na derme. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que as NL-FUCO são um sistema promissor para aplicação cutânea. O Capítulo IV apresenta a avaliação toxicológica in vitro da FUCO e das NL-FUCO, através dos ensaios de citotoxicidade por MTT, vermelho neutro e o método de exclusão com azul de Tripan. Concomitantemente, foram avaliadas as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e o potencial de membrana mitocondrial. A partir dos resultados obtidos, NL-FUCO se mostrou biocompatível com células 3T3 até a concentração de 80 μg/mL. Houve aumento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e do potencial de membrana mitocondrial, sugerindo que a FUCO possui capacidade pró-oxidante e impulsiona a síntese de adenosina trifosfato (ATP). Porém, são necessários estudos para a investigação da toxicidade in vivo das NL-FUCO. No Capítulo V, descreve-se o papel da quitosana no revestimento das NL-FUCO. O revestimento com quitosana aumentou o tamanho das NL, entretanto os valores se mostraram adequados para sistemas nanométricos. Com a análise do potencial zeta e a da MET pode-se confirmar a presença do revestimento com quitosana. O estudo de bioadesão in vitro foi realizado com membrana de casca de ovo e confirmou que revestimento de quitosana aumentou significativamente a bioadesão das NL. O estudo de proliferação in vitro evidenciou que as LN-FUCO mantiveram as propriedades de proliferação da quitosana.

Fucoxanthin (FUCO) has shown promising effects in the cancer treatment, such as apoptosis promoter, cell cycle arrest, inhibition of metastasis and cutaneous action in UVB induced melanogenesis. Lipid nanoparticles (LN) are prominent compared to other systems and new raw materials are being used for the preparation, highlighting the raw materials coming from the Brazilian Amazon. However, FUCO is an unstable molecule, which limits its use. Therefore, the present work aims to develop of innovative LN containing a combination of bacuri butter and tucumã oil for the incorporation of FUCO (LN-FUCO). Chapter I presents the characterization by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance of FUCO raw material, which was acquired in two presentations, incorporated in an oil and powder. The two FUCO raw materials were identified as total-trans and 9'-cis FUCO. In the next step, an analytical method was developed for the quantification and quality control of FUCO and its isomer by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). For this, a C18 column, isocratic mobile phase composed of acetonitrile and water pH 7.0 (9.5:0.5 v/v) and detection at 450 nm were used. The results demonstrated that the method is linear in the concentration range studied, accurate and precise. The robustness of the method was evaluated by the Box-Behnken experimental design, demonstrating that the modifications in the factors studied did not interfere in the quantification of FUCO. In Chapter II, the innovative LN were developed, six formulations were prepared, varying the proportion of the butter of bacuri and of the oil of tucumã, by high shear homogenization method. In the next step, these formulations were characterized and the results indicated that the mean diameter of LN were lower than 255 nm, polydispersion index (pdI) lower and zeta-potential between -11 mV and -24 mV. The assessment of morphology by transmission electron microscopy showed spherical homogeneous and with nanometric dimensions particles. In the stability study, all formulations were stable for two months at room temperature; however, the formulation with 5% bacuri butter and 4% tucumã oil presented the best result. Chapter III describes the incorporation of FUCO in the innovative LN. The LN-FUCO presented a mean diameter of 243 nm, pdI lower, high entrapment efficiency and adequate drug loading. The HPLC method for quantification of FUCO in LN was shown to be linear, precise and accurate. In the second step, the LN-FUCO were incorporated in a hydrogel and presented a suitable pH for cutaneous application, maintaining its nanometric dimension, with pdI lower and close to 100% drug loading. In the study of photostability with UVA light, LN protected FUCO. In the stability study, LN-FUCO were stable for 45 days stored at 6 °C, 25 °C and 40 °C. The dissolution studies indicated a sustained release of FUCO from LN as compared to FUCO free. Through in vitro skin permeation studies, it was possible to quantify the FUCO in the epidermis and dermis and to demonstrate the ability of LN to modify the FUCO permeation. When the stratum corneum was removed, FUCO concentrations increased in the epidermis and in the dermis. In conclusion, the results obtained demonstrate that LN-FUCO is a promising system for cutaneous application. Chapter IV presents the in vitro toxicological evaluation of FUCO and LN-FUCO through MTT assay, neutral red, and trypan blue dye exclusion test. Concomitantly, the reactive oxygen and nitrogen species and the mitochondrial membrane potential were evaluated. From the results, LN-FUCO is biocompatible with 3T3 cells up to the concentration of 80 μg/mL. There were increased reactive species and mitochondrial membrane potential, suggesting that FUCO possesses pro-antioxidant capacity and boosts the synthesis of adenosine triphosphate (ATP). However, studies are needed to investigate the in vivo toxicity of LN-FUCO. In Chapter V describes the role of chitosan in the coating of LN-FUCO. The chitosan coating increased the size of the LN; however the values were shown to be adequate for nanometric systems. The presence of chitosan can be confirmed by the analysis of the zeta-potential and MET. In vitro bioadhesion study was performed with egg shell membrane and confirmed that chitosan coating significantly increased the bioadhesion of LN. In vitro study showed that the LN-FUCO maintained the proliferation properties of chitosan.