Bacterial composition of microbiome associated to supragingival biofilm in health and caries disease

Abstract

This research compared the bacterial composition profile and diversity from supragingival biofilm collected in different oral conditions from active- and inactive-caries subjects, and from caries-free subjects. Sixteen individuals (13-76; med=23.5 years-old), selected at the Faculty of Dentistry, Federal University of Rio Grande do Sul, were allocated in three groups: cariesactive (CA) (n=7); caries inactive (CI) (n=3); and, caries-free (CF) (n=6). Twenty-one supragingival plaque samples (pools) were obtained from CA subjects from three dental health conditions: ANCL: active non-cavitated lesions (n=7); INCL: inactive non-cavitated lesions (n=7); S: sound dental surfaces (n=7). The supragingival biofilm was collected after 12 hours without toothbrushing, stored in RNA stabilization solution, pelleted and frozen in -80oC. The total RNA extraction was made using Lysozyme and UltraClean® Microbial RNA Isolation kit (MO-BIO). The genomic libraries were prepared using True Seq® Sample Preparation Guide, Low Sample (LS) Protocol Illumina (Illumina, Inc., San Diego, CA), and sequenced by Illumina HiSeq 3000, resulting in billions of 2x150 base pairs. The sequences were uploaded into sever MG-RAST (Metagenomics Analysis Server) for bioinformatics analysis. High-quality sequences (3,542,190) were clustered into genus operational taxonomic units (OTUs; 97% identity; SILVA SSU), representing 915 independent genera belonging to 29 phyla, four considered higher abundant (Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Fusobacteria). All subjects shared 4493 OTUs (123 genera), indicating the presence of a core plaque microbiome. The α diversity analysis showed less bacterial diversity in sound sites from caries active compared to caries-free (CA-S vs CF-S), and for caries active subjects versus caries-free subjects (CA vs CF). The dominant genera included Actinomyces, Corynebacterium, Capnocytophaga, Leptotrichia, Veillonella, Prevotella, Streptococcus, Eubacterium, and Neisseria. Veillonella and Leptotrichia were positively related with caries, and Prevotella with health. Corynebacterium and Capnocytophaga were closer than Actinomyces but toghether formed an important cluster with high abundance in health and disease. The Metric Multidimensional Scaling Ordination analysis shows that sites from active subjects (CAANCL, CA-INCL and CA-S) are closer to each other than CI-INCL subjects or CF-S subjects. We found a high level of diversity in the active fraction of the bacterial community (RNAbased approach) that is related with the high number of organisms detected in supragingival biofilm and not due to dead or inactive species, highlighting that dental caries is a polymicrobial disease, where multispecies microbial consortia are metabolically active in the lesions. Supragingival bacterial communities presents an intrapersonal similarity, but interpersonal diversity and different bacterial composition reveals that the subject’s caries activity status matters more than sites.

Esta pesquisa comparou o perfil e diversidade da composição bacteriana do biofilme supragengival coletado em diferentes condições bucais de sujeitos carie ativos, carie inativos e livres de caries. Dezesseis indivíduos (13-76; med=23.5 anos), selecionados na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, foram alocados em três grupos: cárie ativos (CA) (n=7); cárie inativos (CI) (n=3); e, sem experiência de cárie (CF) (n=6). Vinte e uma amostras de placa supragengival (“pool”) foi obtida dos sujeitos CA a partir de três condições de saúde dental: LNCA: lesão não cavitada ativa (n=7); LNCI: lesão não cavitada inativa (n=7); S: superfície saudável. O biofilme supragengival foi coletado depois de 12 horas sem escovação dental, armazenado em solução estabilizadora de RNA, concentrado e congelado a -80oC. O RNA total foi extraído utilizando Lisozima e o kit UltraClean® Microbial RNA Isolation (MO-BIO). As bibliotecas genômicas foram preparadas com o protocolo True Seq® Sample Preparation Guide, Low Sample (LS) Protocol Illumina (Illumina, Inc., San Diego, CA) e sequenciadas no sequenciador Illumina HiSeq 3000, resultando em bilhões de 2x150 pares de base. As sequencias foram enviadas para o servidor MG-RAST (Metagenomics Analysis Server) para as analises de bioinformática. Sequência de alta qualidade (3,542,190) foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs; 97% identidade; SILVA SSU), representando 915 gêneros independentes pertencentes a 29 filos, quatro considerados com elevada abudancia (Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Fusobacteria). Todos os sujeitos compartilharam 4493 OTUs (123 gêneros), indicando a presença de um microbioma central da placa dental. A analise de alfa diversidade revelou uma menor diversidade microbiana para os sítios saudáveis dos sujeitos carie ativos versus os dos sem carie (CA-S vs CF-S), e para os sujeitos carie ativos versus os sujeitos sem carie (CA vs CF). Os generos dominantes incluiram Actinomyces, Corynebacterium, Capnocytophaga, Leptotrichia, Veillonella, Prevotella, Streptococcus, Eubacterium e Neisseria. Veillonella e Leptotrichia foram correlacionados positivamente com caries, e Prevotella com saúde. Corynebacterium e Capnocytophaga estavam mais próximos do que Actinomyces, mas aguparam-se juntos formando um importante “cluster” com elevada abundância tanto em saude como em doença. A análise da Ordenação por Escalonamento Métrico Multidimensional mostra que os sítios nos sujeitos carie-ativos (CA-LNCA, CA-LNCI e CA-S) estão mais próximos uns dos outros do que os sujeitos CI-LNCI ou dos sujeitos CF. Nós observamos um alto nível de diversidade da fração ativa da comunidade bacteriana (abordagem baseada em RNA) que está relacionada com o elevado número de organismos detectados no biofilme supragengival e não devido a espécies mortas ou inativas, destacando que a cárie dentária é uma doença polimicrobiana, onde consórcios microbianos multiespécie são metabolicamente ativos nas lesões. As comunidades bacterianas supragengivais apresentam uma semelhança intrapessoal, mas a diversidade interpessoal e a composição bacteriana diferente revelam que o status de atividade de cárie do indivíduo é mais importante do que os sitios.