Efeito dos processamentos seminais na funcionalidade dos espermatozoides após a criopreservação

Abstract

Introdução: A criopreservação seminal provoca danos significativos no espermatozoide, por isso diferentes métodos de criopreservação têm sido estudados. Objetivos: Comparar os efeitos do processamento pelo gradiente de densidade e o lavado com remoção do plasma seminal concomitantes a criopreservação nos parâmetros seminais, dano oxidativo, fragmentação do DNA, criocapacitação e integridade do acrossoma e mitocôndria. Método: A amostra seminal de 26 pacientes normozoospérmicos foi dividida em 3 partes, uma com plasma seminal, a segunda após realização do lavado e a terceira após seleção pelo gradiente de densidade. As amostras foram criopreservadas por no mínimo duas semanas e os parâmetros seminais, produção de ROS com a sonda DCF, a peroxidação da membrana plasmática com uso da sonda BODIPY, a fragmentação do DNA por TUNEL, a integridade do acrossoma pela sonda FITC/PSA, a desordem lipídica da membrana plasmática pela sonda Merocianina 540 e o potencial mitocondrial pela sonda JC1, foram avaliados por citometria de fluxo e analisados nas amostras antes da criopreservação e após o descongelamento. Resultados: O processamento pelo gradiente de densidade selecionou espermatozoides móveis, com morfologia normal e viáveis (p<0,05). A criopreservação afetou negativamente os parâmetros seminais nos processamentos, mesmo que a recuperação de espermatozoides seja menor no gradiente densidade após o descongelamento a motilidade progressiva, motilidade total, vitalidade e morfologia permaneceram superiores (p<0,05). O gradiente de densidade selecionou células com menor dano oxidativo, menor desordem lipídica da membrana plasmática, maior integridade do DNA e do acrossoma e com maior potencial mitocondrial (p<0,05). A 17 criopreservação não aumentou as ROS, a peroxidação lipídica da membrana plasmática nem dano ao DNA, paralelamente houve prejuízo ao acrossoma, à mitocôndria e a desordem lipídica da membrana plasmática. Conclusão: A criopreservação compromete significativamente os parâmetros seminais (motilidade, morfologia, viabilidade); e acarreta danos estruturais ao acrossoma e as mitocôndrias do espermatozoide. Em pacientes normozoospérmicos o gradiente foi capaz de selecionar espermatozoides de melhor qualidade (integridade do DNA, do acrossoma, da mitocôndria, peroxidação lipídica e da desordem lipídica da membrana plasmática) em comparação aos outros processamentos, sendo que este benefício foi mantido após o e congelamento/descongelamento das amostras.

Background: Seminal cryopreservation causes significant damage to the sperm, therefore, different methods of cryopreservation have been studied. Aim: Comparing the effects of density gradient processing and the washed with seminal plasma removal concomitant to cryopreservation in seminal parameters, oxidative damage, DNA fragmentation, cryo-capacitation and acrosome and mitochondrial integrity. Methods: The seminal sample of 26 normozoospermic patients was divided into 3 parts, one with seminal plasma, the second one after accomplishing the washed and the third one, after the selection through density gradient. The samples were cryopreserved for at least two weeks. The seminal parameters, ROS production with the DCF probe, plasma membrane peroxidation using the BODIPY probe, DNA fragmentation by TUNEL, acrosome integrity by FITC/PSA probe, the lipid disorder of the plasma membrane by the merocyanine 540 probe and the mitochondrial potential by the JC1 probe were evaluated through flow cytometry and analyzed in the samples before cryopreservation and after thawing. Results: Density gradient processing selected mobile and viable sperm with normal morphology (p<0,05). Cryopreservation negatively affected seminal parameters in the processing, and even if the sperm recovery was lower in the density gradient after the thawing, progressive motility, total motility, vitality and morphology remained higher (p<0,05). The density gradient selected cells with lower oxidative damage, lower plasma membrane lipid disorder, higher DNA and acrosome integrity and with higher mitochondrial potential (p<0,05). Cryopreservation did not increase the ROS or the lipid peroxidation of the plasma membrane or damage to the DNA, in parallel, there was damage to the 19 acrosome, the mitochondria and the lipid disorder of the plasma membrane. Conclusion: The cryopreservation significantly compromises the seminal parameters (motility, morphology, viability); and causes structural damage to the acrosome and to the mitochondria of the spermatozoa. In normozoospermic patients, the gradient was able to select better quality spermatozoon (integrity of DNA, acrosome, and mitochondria, lipid peroxidation and plasma membrane lipid disorder) compared to the other processes, and this benefit was kept after the thawing of the samples.